γ-谷氨酰連接酶GCL測試盒谷胱系列_分光法
測定方法:分光光度法
產品規格:50管/48樣
注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
GCL 是 GSH 合成的限速酶,GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調節,如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。
γ-谷氨酰連接酶GCL測試盒谷胱系列_分光法
測定原理:
在ATP和Mg2+存在下,GCL催化Glu和Cys合成γ-谷氨酰Cys;同時ATP去磷酸化產生無機磷分子,通過測定無機磷增加速率,即可計算出GCL活性。
自備儀器和用品:
冷凍離心機、水浴鍋、移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體105mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加6 mL蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑三:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加入蒸餾水1.5 mL充分震蕩溶解。
試劑四:液體7mL×1瓶,室溫保存。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入12 mL蒸餾水,充分震蕩溶解后,緩緩加入400µL濃硫酸(自備),邊加邊攪拌。
粗酶液提取:
1.組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2.細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3.血清等液體:直接測定。
GCL測定操作:
1.分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到660nm,蒸餾水調零。
2.空白管:取1.5mLEp管,依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和蒸餾水24µL,混勻后蓋緊,37℃水浴準確反應15 min;再加入試劑四60µL,混勻后,室溫(25℃左右)8000g,離心10 min,取上清100µL,加入試劑五100µL,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測定660nm處光吸收,記為A空白管。
3.測定管:取1.5mLEp管,依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和上清液24µL,混勻后蓋緊,37℃水浴準確反應15 min;再加入試劑四60µL,混勻后,室溫(25℃左右)8000g,離心10 min,
4.取上清100µL,加入試劑五100µL,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測定660nm處光吸收,記為A測定管。
注意:空白管只需要測定一次。