多重PCR反應中關鍵因素與實驗步驟

時間：2016/5/3閱讀：746

多重 PCR 通過在同一個反應中同時完成多個基因的擴增成為臨床與基礎研究領域中一種簡便快捷的篩選檢測方法。已有大量文獻詳細的討論了通常影響 PCR 反應質量的條件，而在多重 PCR 中常見的困難和重要的實驗因素卻鮮見報道。本文使用多對引物對多重 PCR 的各種條件進行了研究。研究表明，對于成功進行多重 PCR 尤為重要的因素是：用于擴增不同基因的不同引物對之間的相對濃度、 PCR 緩沖液的濃度、循環溫度、氯化鎂和 dNTP 濃度間的平衡。在實驗的基礎上，本文給出了一個多重 PCR 的標準方法，并給出常見問題的解決辦法。

介紹：

多重 PCR 就是在同一個反應管中同時完成多個不同基因擴增的 PCR 反應。這一方法zui早報道于 1988 年（ 6 ），已被成功的用于缺失分析（ 2,8 ），突變（ 14 ）與多態性（ 11 ），以及定量分析（ 10 ）與反轉錄 PCR （ 7 ）等多個 DNA 檢測領域。

PCR 反應中各種試劑的作用已被討論過（ 3,9,12,13 ），也已有許多研究團體對多重 PCR 的方法進行了描述。但是很少有人對影響多重 PCR 結果的因素（如引物濃度、循環條件等）進行過深入的討論（ 5,15 ）。本實驗使用常規含 KCl 的 PCR 緩沖液對 50 種基因的各種組合進行了多重 PCR 反應，針對伴隨多重 PCR 的一些問題，如均一性差、某些基因難以擴出、重復性差等問題，對影響擴增的相關參數進行了研究。基于實驗經驗我們設計了多重 PCR 的標準方法 (Figure 1) ，并提供了對可能碰到的許多問題的解決方案，這對于臨床與基礎研究領域中使用 PCR 技術的工作者都會有所幫助。

材料與方法：

PCR使用的標準溶液和試劑

100 mM 母液的核苷酸 (dNTP) ( 購于 Pharmacia Biotech dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL,USA) 。使用 100μL 、 25μL 、 6.2μL 反應體積得到的結果相同，對于小的反應體積，加樣（尤其是 dNTP ）至關重要。實驗中使用了各種 PCR 儀，經過細微調節后都得到了好的實驗結果。

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多重PCR反應中關鍵因素與實驗步驟

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