1、高質量RNA
成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的zui大值。一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結果（圖2）。另外，分離poly(A)+ RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。但是我個人認為不會，除非mRNA抽提試劑盒或者相關方法對內參以及目的基因的mRNA有選擇性，否則樣本間抽提效率的差別*可以用內參來校正啊。然而，當分析稀有mRNA時，poly(A)+ RNA會增加檢測的靈敏度。

為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。

另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。

為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。
也可以使用Qiagen等公司的特殊RNA保護試劑。Merck的inhibitor是世界*，大家可以選擇性使用。

在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在*鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

2、使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉錄酶
逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。而且降低逆轉錄酶的RNaseH活性會加大RT酶的熱穩定性。通常有點突變和缺失突變兩種，優先選擇缺失突變的。此外AMV酶熱穩定性更高，。

3、提高逆轉錄保溫溫度 

較高的溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。
對于多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物（三種引物都可以的）在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。這個方法可以試一試。但是這個步驟之后反應條件如何設置我沒有經驗，是加入酶和其他反應組分后變性再RT還是直接開始RT程序？我認為后者才對。
此外是否可以考慮加入RNA inhibitor更為安全一些。
還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，并加入預熱的2×的反應混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助于防止較低溫度時所發生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。

然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性后也是如此。上面簡單的處理方法倒是不花錢，呵呵。對這些困難模板的擴增可以使用一些特殊的逆轉錄酶，逆轉錄反應可以置于較高溫度下進行，增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物（GSP）進行cDNA合成時。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。 此外注意不要在高于60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。此外 RNA在高于65℃時開始水解，對于≤1kb的RNA*鏈合成溫度可以為70℃，對于＞1kb的RNA則需要＜65℃。

4、促進逆轉錄的添加劑 

包括甘油和DMSO在內的添加劑加到*鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定并解開RNA二級結構，zui多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受zui多20％的甘油而不降低活性。為了在逆轉錄反應中zui大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為0.4％，這不足以抑制PCR。

5、RNaseH處理 

在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，據認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡRNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產生的信號。對于多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。