樣本實驗方案

概述

1.準備細胞（0.5-1×106細胞/ mL）
2.添加1 µL 500X Nitrixyte 紅色
3.將細胞與測試化合物和Nitrixyte Red在37oC下孵育所需的時間
4.使用FL4通道的流式細胞儀分析細胞

溶液配制

1.儲備溶液

所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。 避免重復凍融循環。
1.1 NONOate陽性對照儲備液（50 mM）：
將200 uL ddH2O加入小瓶NONOate陽性對照（組分B）中，制成50 mM NONOacte陽性對照處理原液。

2.工作溶液

用測定緩沖液（組分C）稀釋50 mM NONOate陽性對照原液，制成1-2 mM NONOate陽性對照工作溶液。

樣品操作及實驗分析

1.對于每個樣品，在0.5 mL溫熱培養基或您選擇的緩沖液中以5×105至1×106細胞/ mL的密度制備細胞。注意：應單獨評估每個細胞系，以確定誘導NO的佳細胞密度。

2.向0.5 mL細胞懸液中加入1 µL 500X Nitrixyte Red（組分A）。注意：對于粘附細胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細胞以保持細胞完整，并在與Nitrixyte Red孵育之前用含血清的培養基洗滌細胞一次。

3.將細胞與測試化合物和Nitrixyte Red在37oC下孵育所需的時間，以生成內源性或外源性NO。注意：適當的孵育時間取決于所用的單個細胞類型和測試化合物。優化每個實驗的孵育時間。注意：我們已在37℃的細胞培養基中使用Raw 264.7細胞與Nitrixyte Red工作溶液，20μg/ mL脂多糖（LPS）和1 mM L-精an酸（L-Arg）孵育16小時。

4.降低已經用Nitrixyte Red預孵育30分鐘的細胞。用1 mM DEA NONOate陽性對照工作溶液重懸細胞，并在37oC下再孵育30分鐘。有關詳細信息，請參見圖1。

5.使用流式細胞儀監測FL4通道（Ex / Em = 630/660 nm）處的熒光強度。