樣本實驗方案

概述

1.準備細胞（0.5-1×106細胞/ mL）
2.將1 µL 500X Nitrixyte 橙色加入0.5 mL細胞懸液中
3.將細胞與測試化合物和Nitrixyte Orange在37°C下孵育
4.用流式細胞儀分析

溶液配制

1.儲備溶液

所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。 避免重復凍融循環(huán)。
1.1 NONOate陽性對照儲備溶液（50 mM）：
將200 µL ddH2O加入小瓶NONOate陽性對照液（組分B）中，制成50 mM儲備液。

2.工作溶液

2.1 NONOate陽性對照
用測定緩沖液（組分C）將NONOate陽性對照原液稀釋至1-2 mM工作溶液。

樣品操作及實驗分析

1.向0.5 mL細胞懸液中加入1 µL 500X Nitrixyte 橙色（組分A）。注意：對于貼壁細胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細胞以保持細胞完整，并在與Nitrixyte Orange孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞一次。

2.將細胞與測試化合物和Nitrixyte Orange在37°C下孵育所需的時間，以生成內(nèi)源性或外源性NO。注意：適當?shù)姆跤龝r間取決于所用的單個細胞類型和測試化合物。優(yōu)化每個實驗的孵育時間。注意：我們已在37°C的細胞培養(yǎng)基中使用Raw 264.7細胞與1X Nitrixyte Orange，20 µg / mL脂多糖（LPS）和1 mM L-精an酸（L-Arg）孵育16小時。

3.降低已經(jīng)用Nitrixyte Orange預孵育30分鐘的細胞。用1 mM DEA NONOate陽性對照工作溶液重懸細胞，并在37°C孵育30分鐘。有關(guān)詳細信息，請參見圖1。

4.使用流式細胞儀監(jiān)測FL2通道（Ex / Em = 488/590 nm）處的熒光強度。