Virus DNA/RNA cDNA Synthesis Kit

描述：本試劑盒采用穩定高效的反轉錄預混體系 5×Golden RT MasterMix 進行 RNA 的反轉錄反應，使用時只需加入模 板、引物和 RNase Free H2O 即可，大大簡化了操作過程、 提高了效率、減少了操作過程中的人為誤差。具有快速簡便、 重復性高、特異性好、靈敏度高和穩定性好的特點。專用于 病毒 DNA/RNA 樣品的反轉錄反應。 該預混體系包含點突變致 RNase H 活性缺失的 Golden MLV Reverse Transcriptase 反轉錄酶、dNTP、反應 Buffer 和 RNase Inhibitor。該試劑盒采用的反轉錄酶去除了 RNase H 活性，從而避免反轉錄過程中降解 RNA。同時經過突變文 庫篩選，使得其熱穩定性更強，可耐受 55℃高溫反應。相比 于低溫條件下反轉錄反應，采用高溫反轉錄可顯著打開 RNA 二級結構，從而提高復雜 RNA 模板的擴增性能、提高反轉 錄 cDNA 的長度和產量，從而提高后續檢測的靈敏度。合成 的鏈 cDNA 可廣泛用于 2nd Strand 的合成、雜交、PCR 擴增、Real-Time PCR 反應等。

組分

儲存：請置于-20°C，可保存 3 年；避免反復凍融。
注：如 5×Golden RT MasterMix 出現沉淀屬正常現象，可用手捂化，混合均勻后使用不影響實驗結果。一步法 cDOn
1. 按以下組分配制反轉錄反應液
病毒 DNA/RNA 樣品 2~10μl
5×Golden RT MasterMix 4μl
*20×Random Primer 1μl
Rnase Free H2O Up to 20μl
*注：反轉錄引物可根據需要改用特異性引物。
2.根據實際情況反轉錄可選擇快速程序或標準程序
快速程序
37°C 15~30min（cDNA 合成）
85°C 5min（失活 MLV）
標準程序
25°C 10min（引物配對）
55°C 30~60min（cDNA 合成）
85°C 5min（失活 MLV）
注：通常在定量 PCR 實驗中使用快速程序進行反轉錄（反轉錄效率>80%），在進行高 GC 含量、含復雜二級結構、長片段的模板轉錄時采用標準程序。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。