全血/血漿/血清總RNA提取試劑盒

該試劑盒是在 TRIzol LS 的基礎上改造而成，主要成分為 TRIzol LS 試劑。利用 TRIzol LS 中的高序鹽成分，可使 RNA 結合于硅膠膜上，通過漂洗、洗脫即可獲得高純度RNA。該試劑盒專門用于血液、血漿/血清、病毒液等液體樣品，可在最短的時間內獲得高純度的 RNA。獲得的總 RNA純度高，沒有 DNA 和蛋白質污染，適用于 RT-PCR、qRT-PCR、芯片分析、Northern Blot 等實驗。藍圖
(1) Washing Buffer（已含乙醇）勿需加無水乙醇，請直接使用。
(2) TRIzol LS 含有強變性劑，請勿直接于皮膚接觸或吞咽，若接觸到皮膚或眼睛請盡快到醫院處理。實驗時務必穿實驗服，戴手套。
儲存：2-8℃避光保存，可保存 2 年。
操作方法
1.取 250 μl 抗凝全血、血漿、血清、病毒液樣本（體積不足時，加水至 250 μl），加入至 750 μl TRIzol LS 試劑中，然后立即手腕用力上下顛倒混合均勻，靜置 5min；如樣本為糞便等固體樣品，可用 PBS 重懸樣品，并勻漿后，3000 rpm離心 5min，取上清作為病毒液樣品，操作同上。
2. 向上述溶液中加入 0.2 ml 氯仿，手腕用力振蕩 15s，室溫放置 2min。
3. 13000rpm 離心 5min，準確吸取 0.5 ml（吸入過多或過少均影響回收率）無色上清至新的 1.5 ml EP 管中。
4. 向上述 0.5 ml 上清液中加入 0.3ml 異丙醇，手腕輕柔上下顛倒數次，并倒入吸附柱中，13000rpm 離心 15s。
5. 向吸附柱中加入 500 μl Washing Buffer，13000rpm 離心15s；重復此步驟一次。
6. 將吸附柱重新放回離心機，13000rpm 空離心 2min，將殘留的乙醇甩干。
7. 將吸附柱芯放入到 1.5 ml Nuclease Free 收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50 μl Nuclease Free H2O，室溫放置 2min,13000rpm 離心 1min，洗脫液即為 RNA 產物，冷凍保存。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。