Exonuclease III

描述： 核酸外切酶 III 來源于 E.coli，具有 3′-5′外切酶活性，它作用于雙鏈 DNA，從 3′ OH 末端方向逐步切去單核苷酸；每次酶與底物結(jié)合催化，只有幾個核苷酸被除掉，從而在 DNA 分子群內(nèi)產(chǎn)生漸進缺失。該酶的底物為平末端、5′突出末端雙鏈 DNA 分子，但也可作用于雙鏈 DNA 的缺刻處，從 3′降解 DNA 分子，釋放 5′單核苷酸。對于 3′突出末端，尤其是多于 4nt 的幾乎不切割, 亦不能切割硫代磷酰脂鍵。核酸外切酶 III 的活性部分依賴螺旋結(jié)構(gòu)，并根據(jù)序列的不同 而有差異（C＞A=T＞G）。另外，核酸外切酶 III 還具有脫嘌呤/嘧啶-核酸內(nèi)切酶活性、RnaseH 活性和 3′磷酸酶活性。

活性定義：50 μl 反應(yīng)體系中，37℃ 條件下，30 分鐘
催化 E.coli DNA 產(chǎn)生 1 nmol 酸可溶性產(chǎn)物所需要的量定義為一個活性單位。
應(yīng)用： 非定向巢式缺失定點突變鏈特異性探針的制備
制備用于雙脫氧測序的單鏈底模板
熱失活：70°C，20min。
1X Exonuclease III Buffer: 10 mM Bis-Tris（pH 7.0），10
mM MgCl2，1 mM DTT。
酶儲存液：50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM
DTT, 25% Glycerol.
儲存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反復凍融。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。