Exonuclease T

核酸外切酶 T（Exo T），又稱為 RNase T，是一種單鏈 RNA 或 DNA 特異性核酸酶，該酶需要游離的3′ 末端，以 3′-5′ 方向去除核苷酸。核酸外切酶 T 可用于將含有 3′ 突出末端的 RNA 或 DNA 生成平末端。
本產品是通過重組表達 Exonuclease T 基因而得的高純度蛋白，無核酸內切酶和其他外切酶的污染。
活性定義：在 100 μl 反應體系中，25℃ 條件下，30 分鐘內能從 1 nmol [3H]-標記的聚胸腺嘧啶核苷催化產生0.1 nmol 的可溶于TCA的 DNA 所需要的酶量定義為一個活性單位。
1X Exonuclease T Buffer
50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)2，1mM DTT（pH 7.9）
熱失活：65°C，20min。
酶儲存液：10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, 200 μg/ml BSA, pH 7.5。
儲存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反復凍融。
注意事項
核酸外切酶 T 對 RNA 和 DNA 具有不同的活性。對于RNA，在標準反應條件下，通過凝膠電泳檢測，1 單位核酸外切酶 T 可以消化 1.0 pmol 的 rA20。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。