RNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）使用說明書

（貨號：WLRN8206KIT）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，反應體系中的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進行快速核酸擴增反應。依賴nfo酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用膠體金技術（三明治夾心法）可以對zui終結果進行檢測。

產品特點：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短（僅需12 mins）等優點，反應組分為干粉狀態，操作簡便，易于保存。

本試劑對設備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進行反應操作，無需購買PCR擴增儀等價格高昂的專屬設備。

引物設計：

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標記一個修飾基團（常用shengwusu）。引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

熒光探針設計：

在上下游引物中間，設計一段長度為46-52nt與目的片段互補的序列；5’端修飾一個抗原標記（典型FAM）; 在5’端和3’末端的中部位置標記一個dSpacer（si氫呋喃，THF），作為nfo的識別位點；3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer等。

試劑盒組成：

試劑盒儲存：

運輸條件：低溫運輸；

儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復凍融；

產品有效期：12個月。

操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1) 每個干粉反應管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需*融化混勻，否則會對實驗效果產生影響）；

2) 每個反應管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中）；

3) 向反應管中依次加入11.5 μL ddH₂O和2 μL核酸模板（可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH₂O體積，至模板與ddH₂O總體積為13.5 μL）；

4) zui后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（對于多個反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側，上下顛倒反應管8-10次混勻）；

5) 混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入恒溫設備中37-39 oC孵育8-12 mins；

6) 反應結束后，取10 μL加入含有190 μL ddH₂O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 mins內觀察質控線與檢測線判讀結果。

體系配制

注意事項：

1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進行反應時請注意避免微量核酸污染，并盡量考慮設置空白對照以確認是否有核酸污染。

2． 試劑盒保質期12個月。每次使用時，請取出實驗所需的MIRA反應單元的數量，置于冰浴條件下并在8小時內使用；剩余部分，請置于存儲條件下。