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上海永葉生物科技有限公司

雙酶切連接反應(yīng)之全攻略

時(shí)間:2011-10-28閱讀:394
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前一陣子一直在做雙酶切質(zhì)粒重組,失敗了很多次,不過很快改善了實(shí)驗(yàn)方法,用2周重組了14個(gè)質(zhì)?!,F(xiàn)就自己的體會,結(jié)合丁香園戰(zhàn)友的寶貴經(jīng)驗(yàn),談一下質(zhì)粒重組的一些個(gè)人經(jīng)驗(yàn)。

  1、回收PCR產(chǎn)物:在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)候,給引物兩端設(shè)計(jì)好酶切位點(diǎn),一般說來,限制酶的選擇非常重要,盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點(diǎn)后,在各個(gè)酶的兩邊加上保護(hù)堿基。

  雙酶切時(shí)間及其體系:需要強(qiáng)調(diào)的是很多人建議酶切過夜,其實(shí)*沒有必要,我一般酶切3個(gè)小時(shí),其實(shí)1個(gè)小時(shí)已經(jīng)足夠。應(yīng)用大體系,如100微升。

  純化問題:純化PCR產(chǎn)物割膠還是柱式,我推薦柱式,因?yàn)楦钅z手法不準(zhǔn),很容易割下大塊的膠,影響純化效率?,F(xiàn)在的柱式純化號稱可以祛除引物,既然如此,酶切掉的幾個(gè)堿基肯定也會被純化掉了。所以,PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化。我用的是TAKARA的純化柱試劑盒

  酶量的問題:以TAKARA的為例,其對1單位酶的定義如下:在50μl反應(yīng)液中,30℃溫度下反應(yīng)1小時(shí),將1μg的λDNA*分解的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。而該酶濃度約為15單位/微升,在除外酶降解的因素外,該酶可分解15μg的DNA,而一般從1-4ml菌液提出的DNA約為3μg,而PCR純化后的產(chǎn)物(50體系)約為3μg,所以即便全部加進(jìn)去,只要純化的質(zhì)量好,酶切*切得動。

  2、酶切、回收后的PCR產(chǎn)物與載體的連接

  摩爾比的計(jì)算,很多人憑經(jīng)驗(yàn)也可以。但對于初學(xué)者從頭認(rèn)真計(jì)算則非常有必要?;厥盏妮d體片段:回收的PCR產(chǎn)物片段=1:10,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol。

  pmol為單位的DNA轉(zhuǎn)換為為µg單位的DNA:(Xpmoles×長度bp×650)/1,000,000(注:長度bp×650是該雙鏈DNA的分子量)所得數(shù)值即為µg,也可以直接用這個(gè)公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如載體是5380bp,則0.03pmol為

  0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

  測DNA濃度可以在機(jī)子上測,注意OD值,一般約1.8-2.0.另外,如果嫌麻煩,也可用MARKER進(jìn)行估測,如MARKER2000,5微升的MARKER每個(gè)條帶約50ng。

  連接反應(yīng):TAKARA的連接酶上的說明寫的過夜,而其對連接酶單位的定義為:在20μl的連接反應(yīng)體系中,6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反應(yīng)30分鐘時(shí),有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。而它的濃度為350U/μl,所以*夠用。連接酶容易失活,注意低溫操作,在冰上。時(shí)間3個(gè)小時(shí)足已。

  3、轉(zhuǎn)化:

  a、全量(10μl)加入至100μlJM109感受態(tài)細(xì)胞中,冰中放置30分鐘。

  b、42℃加熱45秒鐘后,再在冰中放置1分鐘。

  c、加入890μlAMP陰性培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。

  取100μl鋪板。也可離心后余100μl

  幾個(gè)非常重要的問題

  1做轉(zhuǎn)化的時(shí)候,進(jìn)行酶連接反應(yīng)時(shí),注意保持低溫狀態(tài),因?yàn)長IGASE酶很容易降解.為保險(xiǎn)起見,一般連接3小時(shí),16度.

  2對含有AMP-RESISTENCE的質(zhì)粒鋪板時(shí),注意加AMP時(shí)的溫度,溫度過高,會使克隆株無法篩選出來.我的方法是培基高溫消毒后放在烤箱里,烤箱一般溫度為55-60度,然后做的時(shí)候拿出來,這樣好掌握溫度。鋪板前后注意用吹風(fēng)機(jī)吹干

  3對照的設(shè)立:

  為驗(yàn)證雙酶切是否成功,可做如下對照:

  A酶切反應(yīng)時(shí)加各單酶分別切,兩管,用同一種BUFFER,跑膠,看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.

  做轉(zhuǎn)化時(shí),也要進(jìn)行對照.

  設(shè)4個(gè):

  A.即拿雙酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物也進(jìn)行連接反應(yīng),這個(gè)對照可進(jìn)一步看雙酶切是否成功,如果長出克隆,說明很有可能只進(jìn)行了單酶切,如沒長出克隆,則證明雙酶切成功,當(dāng)然要保證感受態(tài),培基,連接酶都'正常'的情況下.

  B.酶切過的未進(jìn)行連接反應(yīng)的雙酶切產(chǎn)物,進(jìn)行轉(zhuǎn)化,這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質(zhì)粒

  C.設(shè)原始質(zhì)粒為對照,意為檢測整個(gè)操作過程中是否有誤.

  D.AMP陰性板上用同一批感受態(tài)細(xì)胞鋪板20微升足夠,檢測感受態(tài)狀況.

  4.所有的試劑切記低溫保存.一步一個(gè)腳印.不要偷懶,圖省事zui后卻更費(fèi)事.注意設(shè)立對照。

  經(jīng)PCR鑒定,克隆90%-100%的陽性率,所以在后面的挑克隆中,我只挑選4個(gè)就足夠了。然后雙酶切鑒定,測序。。。。。。

 

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