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上海永葉生物科技有限公司

雙酶切連接反應之全攻略

時間:2011-10-28閱讀:389
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前一陣子一直在做雙酶切質粒重組,失敗了很多次,不過很快改善了實驗方法,用2周重組了14個質粒。現就自己的體會,結合丁香園戰友的寶貴經驗,談一下質粒重組的一些個人經驗。

  1、回收PCR產物:在進行PCR擴增時候,給引物兩端設計好酶切位點,一般說來,限制酶的選擇非常重要,盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點后,在各個酶的兩邊加上保護堿基。

  雙酶切時間及其體系:需要強調的是很多人建議酶切過夜,其實*沒有必要,我一般酶切3個小時,其實1個小時已經足夠。應用大體系,如100微升。

  純化問題:純化PCR產物割膠還是柱式,我推薦柱式,因為割膠手法不準,很容易割下大塊的膠,影響純化效率。現在的柱式純化號稱可以祛除引物,既然如此,酶切掉的幾個堿基肯定也會被純化掉了。所以,PCR產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。我用的是TAKARA的純化柱試劑盒

  酶量的問題:以TAKARA的為例,其對1單位酶的定義如下:在50μl反應液中,30℃溫度下反應1小時,將1μg的λDNA*分解的酶量定義為1個活性單位(U)。而該酶濃度約為15單位/微升,在除外酶降解的因素外,該酶可分解15μg的DNA,而一般從1-4ml菌液提出的DNA約為3μg,而PCR純化后的產物(50體系)約為3μg,所以即便全部加進去,只要純化的質量好,酶切*切得動。

  2、酶切、回收后的PCR產物與載體的連接

  摩爾比的計算,很多人憑經驗也可以。但對于初學者從頭認真計算則非常有必要。回收的載體片段:回收的PCR產物片段=1:10,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol。

  pmol為單位的DNA轉換為為µg單位的DNA:(Xpmoles×長度bp×650)/1,000,000(注:長度bp×650是該雙鏈DNA的分子量)所得數值即為µg,也可以直接用這個公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如載體是5380bp,則0.03pmol為

  0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

  測DNA濃度可以在機子上測,注意OD值,一般約1.8-2.0.另外,如果嫌麻煩,也可用MARKER進行估測,如MARKER2000,5微升的MARKER每個條帶約50ng。

  連接反應:TAKARA的連接酶上的說明寫的過夜,而其對連接酶單位的定義為:在20μl的連接反應體系中,6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反應30分鐘時,有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位(U)。而它的濃度為350U/μl,所以*夠用。連接酶容易失活,注意低溫操作,在冰上。時間3個小時足已。

  3、轉化:

  a、全量(10μl)加入至100μlJM109感受態細胞中,冰中放置30分鐘。

  b、42℃加熱45秒鐘后,再在冰中放置1分鐘。

  c、加入890μlAMP陰性培養基,37℃振蕩培養60分鐘。

  取100μl鋪板。也可離心后余100μl

  幾個非常重要的問題

  1做轉化的時候,進行酶連接反應時,注意保持低溫狀態,因為LIGASE酶很容易降解.為保險起見,一般連接3小時,16度.

  2對含有AMP-RESISTENCE的質粒鋪板時,注意加AMP時的溫度,溫度過高,會使克隆株無法篩選出來.我的方法是培基高溫消毒后放在烤箱里,烤箱一般溫度為55-60度,然后做的時候拿出來,這樣好掌握溫度。鋪板前后注意用吹風機吹干

  3對照的設立:

  為驗證雙酶切是否成功,可做如下對照:

  A酶切反應時加各單酶分別切,兩管,用同一種BUFFER,跑膠,看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.

  做轉化時,也要進行對照.

  設4個:

  A.即拿雙酶切的質粒產物也進行連接反應,這個對照可進一步看雙酶切是否成功,如果長出克隆,說明很有可能只進行了單酶切,如沒長出克隆,則證明雙酶切成功,當然要保證感受態,培基,連接酶都'正常'的情況下.

  B.酶切過的未進行連接反應的雙酶切產物,進行轉化,這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質粒

  C.設原始質粒為對照,意為檢測整個操作過程中是否有誤.

  D.AMP陰性板上用同一批感受態細胞鋪板20微升足夠,檢測感受態狀況.

  4.所有的試劑切記低溫保存.一步一個腳印.不要偷懶,圖省事zui后卻更費事.注意設立對照。

  經PCR鑒定,克隆90%-100%的陽性率,所以在后面的挑克隆中,我只挑選4個就足夠了。然后雙酶切鑒定,測序。。。。。。

 

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