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用于熒光定量PCR儀的化學染料有多種,包括SYBR Green I、分子 Beacons、水解探針(TaqMan 探針)、ScorpionsTM 探針和AmplifluorTM系統(tǒng)。也可完成實時量化和DNA解鏈曲線。
SYBR Green I
SYBR Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后,其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR Green I的zui大吸收波長約為497nm,發(fā)射波長zui大約為520nm。
SYBR Green I在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點,由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合,不必因為模板不同而特別定制,因此設(shè)計的程序通用性好,且價格相對較低。此外,由于一個PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合,因此SYBR Green I的靈敏度很高。但是,由于SYBR Green I與所有的雙鏈DNA相結(jié)合,因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響1。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量結(jié)果。
分子 Beacons
分子 Beacons是一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中,位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中,熒光基團被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子,而是將能量傳遞給淬滅劑,這一過程稱為熒光諧振能量傳遞(FRET)。由于”黑色” 淬滅劑,由熒光基團產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個熒光基團是淬滅劑,其釋放能量的波長與熒光基團的性質(zhì)有關(guān)。 (生物秀實驗頻道 )
分子Beacons的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中,環(huán)一般為15-30個核苷酸長,并與目標序列互補;莖一般5-7個核苷酸長,并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團連接在莖臂的一端,而淬滅劑由連接于另一端。分子Beacons必須非常仔細的設(shè)計,以致于在復性溫度下,模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),模板存在時則與模板配對。與模板配對后,分子Beacons的構(gòu)象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時,它發(fā)出自身波長的光子。
分子Beacons不同于SYBR Green的一個優(yōu)點就是它特異性地檢測感興趣的目標DNA。通過精心設(shè)計分子Beacons和優(yōu)化反應條件(溫度和緩沖液)后,其靈敏度非常高,可用于單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的檢測。但是,為檢測某一特定的目標DNA,每一個探針都必須單獨地仔細地設(shè)計。
分子Beacons是美國紐約公共健康研究學會的技術(shù)。
水解探針(TaqMan 探針)
TaqMan探針是多人擁有的技術(shù)。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針,它的熒光與目的序列的擴增相關(guān)。它設(shè)計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的5’末端,而淬滅劑則在3’末端。
當完整的探針與目標序列配對時,熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時,聚合酶的5’外切酶活性將探針進行酶切,使得熒光基團與淬滅劑分離。TaqMan探針適合于各種耐熱的聚合酶,如DyNAzymeTM II DNA聚合酶(MJ Research公司有售)。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加,釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。
ScorpionsTM 探針
ScorpionsTM 探針包括一個擴增引物和一個目標特異性探針,探針部分通過堿基互補形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),使得熒光基團與淬滅劑靠近。(生物秀實驗頻道 )
在擴增過程中,目標序列的延伸通過ScorpionsTM 探針的引物部分來完成。在變性后降溫過程中,通過單分子重組,ScorpionsTM 探針的探針部分與擴增產(chǎn)物結(jié)合,互補的莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞,使得熒光基團與淬滅劑分離。由于ScorpionsTM 探針是擴增產(chǎn)物的一部分。因此熒光強度與擴增的目標序列數(shù)量直接相關(guān)。
AmplifluorTM 通用檢測系統(tǒng)
Amplifluor系統(tǒng)使用一個通用的引物,只有在引物進入到擴增產(chǎn)物中之后才能發(fā)出熒光信號。此引物包含一個18堿基的序列(”Z 序列”),”Z 序列”互補形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),在發(fā)夾結(jié)構(gòu)上標有熒光基團與淬滅劑。首先,目標序列通過特異性引物進行擴增,其中一個引物的5’端加上了Z序列。在隨后的擴增循環(huán)中,通用引物與Z序列配對并進行擴增,從而進行擴增產(chǎn)物中。在此過程中,發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開,使得熒光基團與淬滅劑分離,因此發(fā)射的熒光信號的強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量成正比。
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