免疫金銀染色方法敏感、簡便、省時、安全可靠，葡萄球菌A蛋白（SPA）金標記四步法是在此基礎上發展起來的更為敏感的一種新方法。SPA和許多哺乳類動物IgG具有親和性，且它們之間的連接不會干擾抗原——抗體的結合。簡單的SPA金標記二步法后，第三步用抗SPA與SPA金表面分子通過Fab或Fc段相結合，結果結合更多的膠體金顆粒，再通過銀增強，使原始信號得到幾何級放大，其染色原理見圖。

雙PAG免疫金銀染色原理

（一）染色流程：

（1）石蠟切片常規脫蠟至水，0.05mol/L（pH7.4）TBS洗3×3min.

（2）0.1%*37℃消化20min,或抗原修復20min（98℃），自然冷卻至室溫。

（3）0.05mol/L（pH7.4） TBS洗3×3min.

（4）1%EA（卵蛋白）15min,不洗。

（5）適當稀釋的特異抗體室溫4h或4℃孵育20h,或37C孵育30min.

（6）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗3×5min.

（7）0.02mol/L（pH7.4）TBS（內含0.1%BSA）洗10min.

（8）1%EA 15min,不洗，滴加PAGlonm 1:40稀釋，室溫1h,

（9）0.05mo!/L（pH7.4）TBS洗10min.

（10）兔抗SPAIgGl:400稀釋，37℃ 30min.

（11）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗10min.

（12）滴加PAGlonm 1:60稀釋，室溫1h,或37℃ 30min.

（13）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗10min.

（14）1%戊二醛洗10min.

（15）雙蒸水洗5min.

（16）1%明膠洗5min.

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