一、樣品制備

對于Western Blotting實驗而言，樣品處理是關鍵步驟之一，獲得的蛋白樣品必須均質、可溶，并解離成單個多肽亞基，且盡量減少相互間的聚集，使其zui終僅依賴本身的分子量大小進行分離。當目標蛋白的含量很低時，需要選取目標蛋白含量較高的組織或細胞器（如核抽提物），或者通過免疫沉淀等方式進行富集。通常樣品有重組蛋白、細胞和組織等。

1. 樣品收集

1）培養的細胞

貼壁和懸浮細胞收集方式不同，細胞裂解液種類各異，推薦含SDS的凝膠加樣緩沖液裂解，煮沸即可。

2）動物組織

與細胞不同，組織塊由于體積較大，須預先經破碎勻漿處理。

2. 樣品定量

樣品電泳前需測定蛋白濃度，以便保證上樣量一致，有利于后續定量或半定量分析。常用的蛋白質濃度測定方法有好多種，其靈敏度和所需時間不同，且不同的方法會受不同干擾物質的影響，實驗者可根據樣品制備方法（裂解液成分、去垢劑和還原劑種類等）自行選擇。

幾種蛋白質濃度測定方法比較

注意事項：

a. 應盡量避免引入影響后續定量的雜蛋白（如細胞培養液、蛋白酶抑制劑等）及其他干擾物質；

b. 樣品濃度應適中，1×SDS凝膠加樣緩沖液建議用量：貼壁細胞按10cm2培養皿/0.1ml,懸浮細胞按5×106細胞/0.1ml比例加入；

c. SDS對蛋白質變性和電泳分離至關重要，濃度應控制在2-10%之間，并根據具體需要調整；

d. 制備好的樣品可以在-20℃保存，但時間不宜過長，并避免反復凍融，否則蛋白會發生降解；

e. 內參對實驗結果至關重要，應選擇合適的內參。

二、電泳

電泳分為非變形凝膠電泳和變性凝膠電泳，Western Blotting中常用的是不連續緩沖系統下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），該法中由于變性的多肽與SDS結合而帶負電荷，在凝膠電泳中遷移率僅與多肽的分子量相關。凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺濃度的函數。

SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍 

注意事項：

a. 根據目標蛋白的分子量選擇合適濃度的凝膠，以達到*的分離效果和分辨率；

b. 分離膠不宜灌注過滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果；

c. 各泳道上樣體積大體一致且適中，體積偏差過大會相互擠壓導致條帶走形，為避免邊緣效應，可在未加樣的泳道加入等量的樣品緩沖液；

d. 電泳時應保持電壓和電流穩定，且不宜過高，否則會造成不規則的蛋白質遷移帶；

e. 如有特殊需要，可以使用梯度膠，高濃度丙烯酰胺可以使低分子量蛋白質形成清晰的條帶，還能在一塊膠內同時分離分子量范圍更大的蛋白質。

三、轉膜

蛋白質經SDS-PAGE分離后，必須及時從凝膠中轉移到固相支持物上，固相支持物能牢固結合蛋白又不影響其抗原活性，而且支持物本身還有免疫反應惰性，這使其比直接在凝膠上檢測更易操作，試劑用量更少，更省時，效果更好。

蛋白質從凝膠向膜轉移的過程普遍采用電轉印法，分為半干式和濕式轉印兩種模式，與SDS結合的蛋白由于帶有負電，在電場中向正極遷移，并zui終結合在固相支持物上。兩種方法均卓有成效，且各有所長，實驗者可根據實驗情況不同進行選擇。

常用固相支持物 

注意事項

a. 樣品屬性、膜類型、膠濃度以及轉移緩沖液均會影響蛋白質的轉移效率，比如小分子量蛋白與大分子量蛋白相比，遷移迅速，但結合不牢固；

b. 蛋白與固相支持物結合的程度受多種因素影響，如膜屬性（孔徑和類型），緩沖液屬性（pH值、鹽離子種類、鹽濃度、去垢劑等），如實驗結果不佳，可分別進行優化；

c. 如果轉膜與電泳的緩沖液系統不同，轉膜前應將凝膠在轉膜緩沖液中平衡，防止凝膠膨脹或收縮，以保證條帶清晰完整；

d. 提高蛋白質轉移效率的方法：轉移緩沖液中加入甲醇或低濃度的SDS （0.02-0.1%），使用小孔徑膜，轉移后立即用戊二醛交聯；

e. 轉膜時間和電流大小可根據蛋白分子量大小靈活調整；

f. 轉移效果可通過染膠（考馬斯亮藍染色或銀染）或染膜（麗春紅S染色、印度墨汁染色）來鑒定。

四、封閉

在進行抗體雜交之前，需要采用異源性蛋白質先對轉印膜進行封閉，防止免疫試劑的非特異性吸附，從而降低背景，增加靈敏度，提高信噪比。常用封閉物有脫脂奶粉和BSA（稀釋于不同的緩沖液中），但不同的抗原-抗體反應，封閉條件均不相同，沒有適合所有系統的封閉液，具體封閉條件（包括封閉液濃度、緩沖液種類、封閉時間、溫度等）需自行優化。

注意事項

a. 影響非特異性結合的因素很多，針對不同的免疫原，其封閉條件均可進行優化，沒有通用的封閉液，因為每個抗原-抗體反應都具有*的性質；

b. 在選擇封閉物時，zui重要的標準是信噪比，封閉條件不足，會導致過多的背景噪音，封閉條件過度，會造成信號變弱；

c. 可根據不同的檢測系統（堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶）、蛋白質屬性（分子量大小）選擇適當的封閉物及緩沖液（PBS或TBS）。

五、雜交

封閉后，目標蛋白便與特異性的一抗進行免疫反應，一抗可以是標記的，也可以是非標記的。標記的一抗與免疫原結合后，可直接進行檢測（直接法），降低了背景和非特異性結合，但信號較弱。非標記的一抗配合標記的二抗使用（間接法），對信號有級聯放大作用，可以增加靈敏性和信噪比。二抗既可標記放射性同位素，也可標記染料或其他分子，或與酶偶聯。常用的酶包括堿性磷酸酶（AP）和辣根過氧化物酶（HRP），通過與底物反應產生光信號。

注意事項

a. 標記方法的選擇視靈敏度和易操作性而定，通常有四種標記系統：化學發光、放射性同位素、熒光、化學熒光；

b. 一般而言，一抗常用非標記的，但遇到特殊實驗需要，可以對一抗進行相應標記；

c. 單抗和多抗各有利弊，多抗便宜、制作省時、親和力高，但特異性不佳；單抗特異性好、純度高、重復性好，但制作工期長，價格較高；

d. 一抗稀釋比例及反應條件（溫度、時間）視抗體效價而定，并需根據實驗結果進行優化，二抗一般可固定一個反應條件（建議1:4000、室溫1小時）；

e. 清洗步驟對移除未結合試劑、降低背景、增加信噪比至關重要，清洗不夠會造成較高背景，清洗過度會導致靈敏度降低，清洗液的成分可適當調整。