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植物磷脂酶C（Phospholipase C）活性酶連續循環反應比色法定量檢測試劑盒

產品說明書

主要用途

植物磷脂酶C（Phospholipase C）活性酶連續循環反應比色法定量檢測試劑是一種旨在通過磷脂酶C、堿性磷酸酶、膽堿氧化酶和過氧化酶酶連續反應系統中，在磷脂酶C抑制劑的存在下，所產生的紅色產物醌亞胺染料，在分光光度儀下峰值的增高，即采用比色法來測定組織裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）或微粒體樣品等磷脂酶C的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

磷脂酶（phospholipase），是一種脂質水解酶，催化磷脂的水解，產生脂肪酸和其它親脂產物，參與磷脂代謝。磷脂酶家屬有四種類型亞酶，包括A、B、C和D。磷脂酶A（phospholipase A；PLA）主要水解磷脂sn-1（磷脂酶A1催化）和sn-2（磷脂酶A2催化）位置上的乙酰基；磷脂酶B（phospholipase B；PLB）同時水解磷脂的sn-1和sn-2位置上的乙酰基，又稱為溶血磷脂酶（lysophospholipase）；磷脂酶C（phospholipase C；PLC；EC3.1.4.3）在磷酸基前（即磷酸和甘油之間）水解，釋放二酰基甘油（diacylglycerol；DAG）和第二信使分子三磷酸肌醇（inositol triphosphate）；磷脂酶D（phospholipase D；PLD）在磷酸基后水解，釋放磷脂酸（phosphatidic acid）。哺乳動物磷脂酶D，又稱為磷脂酰膽堿磷脂酸水解酶（Phosphatidylcholine phosphatidohydrolase），有2個異構體：磷脂酶D1和D2，存在于細胞質膜上。磷脂酶C，又稱為卵磷脂酶（lecithinase）或α-毒素（α-toxin），在細菌培養液上清中存在，具有水解生物膜上的卵磷脂（lecithin），因此會產生溶血、皮膚壞死性（dermonecrotic）和致命作用。磷脂酶C還可以水解鞘磷脂（sphingomylin），腦磷脂（phosphatidylethanolamine）等。在細胞信號傳導通路上起著重要作用。植物磷脂酶C受到鈣離子調節，在生物性或非生物性壓力中發揮作用。其次通過調節脂質信號通路中，控制花粉管生長和植物發育。基于底物卵磷脂（lecithin），在磷脂酶C選擇性抑制劑U73122存在與否的情況下，通過磷脂酶C的作用，水解產生為二酰基甘油和磷酸膽堿（choline phosphate），進而由堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）去磷酸化產生膽堿（choline），后通過膽堿氧化酶（choline oxidase）和過氧化酶（peroxidase）系統，測定紅色產物醌亞胺染料（quinoneimine dye）的峰值變化（500nm 波長），來定量分析磷脂酶C的活性。其連續循環反應系統為：

PLC 

Leicithin  +  H2O     →      Diacylglycerol  +  Choline phosphate

 Alkaline phosphatase 

Choline phosphate  +  H2O     →      Choline  +  Phosphate

choline oxidase

Choline  +  O2  +  H2O  → Betaine aldehyde  +  2 H2O2

            peroxidase

 2 H2O2  +  4-Aminoantipyrine  +  Phenol     →    2 H2O  +   Quinoneimine dye   

產品內容

清理液（Reagent A） 30毫升

裂解液（Reagent B） 10毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應液（Reagent D） 600微升

酶促液（Reagent E） 600微升

底色液（Reagent F） 600微升

陰性液（Reagent G） 600微升

專性液（Reagent H） 100微升

產品說明書     1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃，其余的保存－20℃冰箱里；底色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存和反應操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

一、樣品準備

1．準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定200至500毫克組織重量 

2．（選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管

3．（選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4．即刻用刀片切碎組織

5．放進一個預冷的15毫升錐形離心管

6．加入預冷的1毫升裂解液（Reagent B）

7．渦旋震蕩5秒，充分混勻

8．即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）

9．將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

10．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的1.5毫升離心管

11．（選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

12．放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13．小心移取1毫升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

14．（選擇步驟）放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為105000g 

15．（選擇步驟）小心移取1毫升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

16．移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 BCA蛋白質濃度定量試劑盒－30031.1）

17．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

1．開啟并設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為37℃）：波長500nm，并置零 

2．從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent F）避免光照

3．緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對照測定

1．移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿或96孔板

2．加入25微升反應液（Reagent D）

3．加入10微升陰性液（Reagent G）

4．在37℃溫度下孵育10分鐘

5．加入25微升酶促液（Reagent E）

6．加入20微升底色液（Reagent F）

7．上下傾倒數次，混勻 

8．在37℃溫度下孵育30分鐘，避免光照

9．即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為背景空對照 

四、樣品總活性測定

1．移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿或96孔板

2．加入25微升反應液（Reagent D）

3．加入10微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

4．渦旋震蕩5秒

5．在37℃溫度下孵育10分鐘

6．加入25微升酶促液（Reagent E）

7．加入20微升底色液（Reagent F）

8．上下傾倒數次，混勻

9．在37℃溫度下孵育30分鐘，避免光照

10．即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為樣品總活性讀數  

五、樣品非特異活性測定

1．移取160微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿或96孔板

2．加入10微升專性液（Reagent H）

3．加入10微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

4．在37℃溫度下孵育15分鐘

5．加入25微升反應液（Reagent D）

6．在37℃溫度下孵育10分鐘

7．加入25微升酶促液（Reagent E）

8．加入20微升底色液（Reagent F）

9．上下傾倒數次，混勻

10．在37℃溫度下孵育30分鐘，避免光照

11．即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為樣品非特異活性讀數

六、計算樣品活性

（1）樣品總活性和非特異性活性

比色皿計算

[（樣品讀數－背景讀數）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 12（毫摩爾吸光系數）X 0.5 X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升 

轉換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾磷/分鐘

96孔板計算

[（樣品讀數－背景讀數）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 12（毫摩爾吸光系數）X 0.5 X 0.6 （光徑距離；厘米）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升 

轉換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾磷/分鐘

（2）樣品特異活性

樣品特異活性＝樣品總活性－樣品非特異活性

注意事項

1．本產品為20次（10個樣本）操作，包括背景對照

2．操作時，須戴手套

3．系統操作過程中，背景測定只需1次

4．樣品須澄清，至關重要 

5．比色測定后，比色皿須清洗*

6．樣本測定讀數增高，表明具有酶活性

7．建議待測樣本蛋白濃度為100微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  BCA蛋白質濃度定量試劑盒－30031.1） 

8．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

9．磷脂酶C單位活性定義為：在37℃，pH 7.3條件下，每分鐘內能夠釋放1微摩爾磷所需的酶量作為一個活性單位

10．本公司提供系列磷脂酶檢測試劑產品

質量標準

1．本產品經鑒定性能穩定

2．本產品經鑒定檢測敏感

使用承諾

本公司秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。