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細(xì)菌尿素酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

主要用途

細(xì)菌尿素酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)改良的尿素酶貝特羅反應(yīng)系統(tǒng)中尿素轉(zhuǎn)化為氨分子后峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心改良貝特羅反應(yīng)（Berthelot Reaction）、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌細(xì)胞裂解萃取液樣品尿素酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

許多細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)胞外酶（exoenzyme），稱為水解酶（hydrolase），在水分子的參與下，催化底物的水解，成為細(xì)菌生理特征之一。其中尿素酶（Urease），裂解尿素分子為氨分子和二氧化碳，用以識(shí)別革藍(lán)氏陰性細(xì)菌，例如變形桿菌屬（Proteus group）和幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）等。細(xì)菌尿素酶在水分子的參與下，催化尿素的水解，產(chǎn)生氨分子，與次氯酸鹽和水楊酸作用后呈現(xiàn)墨綠色和峰值的變化（波長(zhǎng)600nm），來(lái)定量測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞尿素酶的活性。貝特羅反應(yīng)（Berthelot Reaction）系統(tǒng)為：

UREASE

UREA  +  H2O       →      2 NH3  +  CO2

          NITROPRUSSIDE  

NH3  +  CIO-  +  2 salicylate    →      GREEN DYE

NaOH

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A） 15毫升

反應(yīng)液（Reagent B）     1.5毫升

底色液（Reagent C） 15毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）     100微升

產(chǎn)品說(shuō)明書     1份

保存方式

保存反應(yīng)液（Reagent B）在-20℃冰箱里；其余的保存在在4℃冰箱里，避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿：用于反應(yīng)和比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

 實(shí)驗(yàn)步驟

一、測(cè)定準(zhǔn)備

1．準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)菌裂解萃取液等），置于冰槽里

2．設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)600nm，并置零 

3．準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管

4．分別加入50微升緩沖液（Reagent A）到每個(gè)離心管

5．移取50微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到1號(hào)管，混勻

6．小心移取50微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到2號(hào)管，混勻

7．小心移取50微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到3號(hào)管，混勻

8．小心移取50微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到4號(hào)管，混勻

9．將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

管號(hào) 緩沖液（Reagent A） 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D） 測(cè)定體系氨分子濃度

1 50微升 50微升 100微摩爾/升

2 50微升 50微升1號(hào)管 50微摩爾/升

3 50微升 50微升2號(hào)管 25微摩爾/升

4 50微升 50微升3號(hào)管 12.5微摩爾/升

5 50微升 0 空白對(duì)照管

二、標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

1．移取400微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2．加入50微升反應(yīng)液（Reagent B）

3．加入50微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液

4．加入500微升底色液（Reagent C）

5．上下傾倒數(shù)次，混勻

6．在37℃溫度下孵育5分鐘

7．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)（A）（注意：實(shí)際讀數(shù)＝標(biāo)準(zhǔn)液讀數(shù)－空白對(duì)照管讀數(shù)）

8．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至6四次

9．構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位的實(shí)際讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)氨分子濃度（微摩爾/升）

三、樣品測(cè)定

1．移取400微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2．加入50微升反應(yīng)液（Reagent B）

3．加入50微升待測(cè)樣品（100微克細(xì)菌細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4．上下傾倒數(shù)次，混勻

5．在37℃溫度下孵育5分鐘

6．加入500微升底色液（Reagent C）

7．上下傾倒數(shù)次，混勻

8．在37℃溫度下孵育5分鐘

9．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)（A）（注意：實(shí)際讀數(shù)＝樣品讀數(shù)－空白對(duì)照管讀數(shù)）

10．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)氨分子濃度

四、計(jì)算樣品活性

[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)氨分子濃度（微摩爾/升）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[ 0.05（樣品容量；毫升）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝納摩爾氨分子/分鐘/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾氨分子/分鐘/毫克

納摩爾氨分子/分鐘/毫升或納摩爾氨分子/分鐘毫克 X 2 =納摩爾氨分子/分鐘/毫升或毫克

注意事項(xiàng)

1．本產(chǎn)品為25次（比色皿）操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液

2．操作時(shí)，須戴手套

3．底色液（Reagent C）含有堿性物質(zhì)，注意操作安全

4．一次操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次

5．樣品須澄清，至關(guān)重要（本公司提供細(xì)菌可溶性總蛋白制備試劑盒－30022.1）

6．樣品中避免含有氨類和氟化物，否則干擾檢測(cè)

7．孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測(cè)定；通常3至5分鐘完成反應(yīng)孵育

8．比色測(cè)定后，比色皿須清洗*

9．建議待測(cè)樣本的蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1） 

10．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

11．酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1納摩爾尿素為2納摩爾氨分子

12．本公司提供系列細(xì)菌生理生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感