感受態細胞轉化操作流程及提高轉化效率的建議有哪些

1、在冰上預冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圓底離心管.1支用來轉化樣品,1支做pUC18對照.同時將NZY+ broth培養基在42°C預熱.
2、冰上融化感受態細胞.融化時輕輕將細胞混勻并分裝成100ul/管.
3、每管中加入隨試劑盒提供的4 ml b-ME(巰基乙醇).
4、溫和轉動試管,將細胞在冰上放置10分鐘,每2分鐘溫和轉動一下.
5、每管細胞加入0.1–50 ng樣品DNA (或2 ml連接反應物)(參見DNA 質量與體積說明.)用滅菌dH2O水按1:10稀釋對照pUC18 DNA,并取1 ml稀釋的pUC18 DNA加入轉化細胞.
6、溫和轉動試管,并在冰上放置30分鐘.
7、試管在42°C水浴熱激30秒.熱激時間對轉化效率極度重要.
8、試管冰浴2 分鐘.
9、每管加入0.9 ml 預熱 (42°C) 的NZY+ 肉湯,37°C、225–250 rpm 搖床培養1 小時.
10、取 200 ml轉化混和物鋪帶有相應篩選抗生素的LB瓊脂糖平板(如果進行顏色篩選還需加入IPTG和X-gal).pUC18陽性對照則取5 ml 鋪氨芐*LB瓊脂糖平板.
    注意:細胞經 1000 rpm離心 10分鐘會聚集,應將細胞沉淀用 200 *l NZY+ 肉湯重懸.如果用于鋪板的細胞 <100 ml,先將細胞加入200 ml培養基中,然后用滅菌涂布棒鋪板.如果采用100 ml細胞則可以直接鋪板.傾斜涂布棒并輕輕拍打,盡量減少涂布棒上的細胞殘留.
11、37°C培養過夜.顏色篩選請參見以下Blue-White Color Screening的操作指南.
12、pUC18陽性對照預計有約250個克隆(?5 × 109 cfu/mg pUC18 DNA).而樣品DNA的轉化效率隨DNA的量和組成(超螺旋或連接產物)有較大差異,大質粒和非超螺旋DNA往往得到較少的克隆