細胞凋亡檢測操作步驟之ELISA法

時間：2013-11-4閱讀：287

細胞凋亡檢測操作步驟之ELISA法

細胞凋亡發生時，內源性核酸內切酶將分解核小體區間的雙鏈DNA，但核小體本身由于由組蛋白緊密結合而免受切割，單克隆抗體可以與核小體形成夾心結構，可通過檢測核小體判斷細胞是否經歷凋亡事件。

（一）原理

細胞凋亡的發生，是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進入核小體間切割DNA,產生180bp～200bp或其倍數的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復合物而不被核酸內切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結構，可特異性檢測細胞溶解物中的核小體片段。

（二）材料與試劑

1.采用試劑盒，生物標記的小鼠抗組蛋白單克隆抗體。

2.過氧化物酶（-POD）標記的小鼠抗DNA單克隆抗體

3.鏈霉親合素包被的微孔板

4.DNA-組蛋白復合物，作為陰性對照。

5.ABTS底物

6.溶解緩沖液

7.溫育緩沖液

8.底物緩沖液

（三）樣品

1.培養細胞或離體細胞的裂解物細胞裂解步驟：收集細胞，離心后，用200µl溶細胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min。

2.培養細胞的上清液

3.血漿（血清）

（四）操作方法

1.取樣品離心后（1 000r/min,10min）,吸取20µl上清液，加入鏈霉親合素包被的培養板孔中。

2.另加入80µl免疫反應試劑含抗-DNA-POD、抗組蛋白-*及溫育緩沖液（按1︰1︰18混合），室溫下孵育2h（置搖床上，250r/min）。

3.取上清，用300µl溫育緩沖液洗滌3次，小心移去洗滌液。

4.加入100µl底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合（置搖床上）。

5.盡快作比色分析（10min～20min內），用底物緩沖液作空白對照，以波長405nm，參考波長492nm進行檢測。

（五）結果判定

按下列公式計算細胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值：

注：mU=吸收值（10-3）=雙孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若樣品的吸收值超過比色測定范圍，應適當稀釋后再檢測。

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上海隆壘生物科技有限公司

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