哺乳動物細胞總RNA的分離

時間：2017/7/18閱讀：803

一、細胞的裂解
單層細胞的裂解
懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解
a．單層細胞的裂解
a）吸出培養液，以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養皿內的單層細胞，重復1次，將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。
b）直徑為90mm的培養皿需加0.5ml RNA提取緩沖液，并使之遍布整個平板的表面。
RNA提取緩沖注液
0.14mol/L NaCL
1.5mmol/L MgCL2
10mmol/L Tris.CL(pH8.6)
0.5％NP-40
1mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）
100單位/ml胎盤rna酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復合物
c）加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。
蛋白酶消化緩沖液
0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
25mmol/L EDTA(pH8.0)
0.3mol/L NaCl
2％ SDS
d）用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。
c）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。
蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。
b．懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解
a）于4℃以2000g離心5分鐘收集細胞，以10倍體積用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀，使其*分散。
b）估計細胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。
c）加入與步驟b）所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。
d）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。
二、提取步驟
1）用等體積酚：仿抽提1次，以去除蛋白質。

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