Institute of Orthopedic Oncology, Fourth Military Medical University, Xi"an 710038, China 摘 要 電穿孔技術(shù)利用電場造成細(xì)胞膜的改變從而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，同時還可用于細(xì)胞融合以及動物克隆等。基因電轉(zhuǎn)移的效率通常比化學(xué)法提高1-2個數(shù)量級，主要與脈沖波形、長度、緩沖液等有關(guān)。方波直流電脈沖應(yīng)用廣泛，在有關(guān)細(xì)胞核移植的多項(xiàng)研究報告中均指出其重要作用。關(guān)鍵詞 基因轉(zhuǎn)移，胚胎克隆，電穿孔

過去十年中，關(guān)于基因功能的研究取得了豐碩的成果，并因此帶動了基因工程、基因治療以及單克隆抗體技術(shù)的進(jìn)步，而在動物生殖生物學(xué)領(lǐng)域的革命性技術(shù)進(jìn)步則導(dǎo)致了綿羊、牛、猴子和小鼠等多種動物的克隆成功。電穿孔技術(shù)和儀器的發(fā)展在這些成就中扮演了重要角色，使得人類不但能從胚胎細(xì)胞克隆動物，甚至能從*分化的成熟細(xì)胞獲得克隆動物。全新的基因操作和生殖技術(shù)將為21世紀(jì)帶來重要的科學(xué)成就。電穿孔技術(shù)是利用脈沖電場改變細(xì)胞膜的狀態(tài)和通透性，達(dá)到將DNA導(dǎo)入細(xì)胞以及促使細(xì)胞發(fā)生融合的目的。該技術(shù)目前一方面應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，另一方面應(yīng)用于細(xì)胞融合制備雜交細(xì)胞和動物克隆等。

1、 在基因轉(zhuǎn)移和雜交瘤中的應(yīng)用

1.1 動物和昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染電穿孔技術(shù)在80年代初期開始用來將DNA導(dǎo)入多種動物細(xì)胞[1]，較之傳統(tǒng)的磷酸鈣和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高等諸多優(yōu)點(diǎn)，特別是對那些其它方法難以奏效的細(xì)胞具有明顯優(yōu)勢，但它的影響因素也比較多。電場強(qiáng)度：電壓太低時，細(xì)胞膜的改變不足以允許DNA分子通過，而電壓過高時又會造成細(xì)胞的不可逆損害。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞細(xì)胞而言，250-2500V/cm的電壓可獲得有效轉(zhuǎn)染[2,3]。電脈沖形狀和長度：電脈沖形狀主要有指數(shù)衰減式和方波兩種，大多歷時20-100毫秒。緩沖液：通常使用和蔗糖等非離子緩沖液，但有報道認(rèn)為HEPES緩沖液的轉(zhuǎn)染效率更高，血清也可以提高轉(zhuǎn)染效率[4]。其它諸如轉(zhuǎn)染溫度，DNA濃度和構(gòu)象等均會對轉(zhuǎn)染效果產(chǎn)生影響。

1.2 大腸桿菌和酵母的轉(zhuǎn)化電穿孔法在80年代末開始被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌[5]，由于細(xì)菌相對較小，因此與DNA導(dǎo)入動物細(xì)胞相比，大腸桿菌通常要求4000-20000V/cm的脈沖強(qiáng)度才能獲得有效轉(zhuǎn)染。化學(xué)法感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率zui高只能達(dá)到每微克DNA 106-108個轉(zhuǎn)化體，而電穿孔法卻可以達(dá)到109-1010個轉(zhuǎn)化體的水平，較前者提高10-100倍，因此在制備cdna文庫等要求較高轉(zhuǎn)化率的工作中就顯得十分關(guān)鍵。 酵母菌電轉(zhuǎn)化克服了乙酸鋰和原生質(zhì)體法煩瑣和轉(zhuǎn)化率低的不足，效率明顯提高[6]。

1.3 細(xì)胞融合制備雜交瘤 細(xì)胞融合主要用于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞[7,8]。在單克隆抗體的制備過程中，傳統(tǒng)用PEG融合法產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，這在現(xiàn)代化生產(chǎn)中存在許多局限性。而電融合法制備雜交瘤可以大規(guī)模地批量、融合，縮短了整個生產(chǎn)周期。除此以外，在細(xì)胞生物學(xué)研究中電融合還被廣泛應(yīng)用于其它雜交細(xì)胞的制備[9]。

2、胚胎工程的核移植和活化 在從簡單的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染到核移植胚胎的電活化中，電穿孔技術(shù)都發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，下面是一些重要的應(yīng)用。

2.1 單性生殖、四倍體及嵌合體

2.1.1 單性生殖中的電活化 反復(fù)的直流方波脈沖可以激活卵母細(xì)胞使其發(fā)生分裂而產(chǎn)生單倍體胚胎。可以通過細(xì)胞松弛素B抑制第二極體或通過電融合來獲得二倍體細(xì)胞。

2.1.2四倍體胚胎的制備 在胚胎的兩細(xì)胞階段應(yīng)用直流脈沖可以導(dǎo)致細(xì)胞融合產(chǎn)生四倍體胚胎。這在小鼠和豬、牛都得到了應(yīng)用[10]。

2.1.3 胚胎干細(xì)胞嵌合體的制備 通過胚胎干細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染可以制備嵌合體轉(zhuǎn)基因小鼠。將干細(xì)胞注入受體的胚泡，然后將這個胚泡轉(zhuǎn)入代理母親子宮。出生的后代之間互相雜交產(chǎn)生純合子可供用于生殖研究。已經(jīng)制備了如小鼠、豬、兔和鳉的胚胎干細(xì)胞嵌合體[11]。