13127537090
當前位置：上海士鋒生物科技有限公司>>技術文章>>差示反轉錄PCR[mRNA差異顯示技術]
mRNA差異顯示技術是由美國波斯頓Dena-Farber癌癥研究所的Liang Peng博士和Arthur Pardee博士在1992年創立的[3]。它也稱為差示反轉錄PCR（differential display of reverse transcriptional PCR）簡稱DDRT-PCR。mRNA差異顯示技術是將mRNA反轉錄技術與PCR技術二者相互結合發展起來的一種RNA指紋圖譜技術，具有簡便、靈敏、RNA用量少、效率高、可同時檢測兩種或兩種以上經不同處理或處于不同發育階段的樣品[4]，該方法自問世以來已被廣泛用于差異表達基因的克隆鑒定研究中。其基本原理是，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個多聚的腺苷酸結構，即通常所說的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為模板，以oligo(dT)為引物合成出cDNA拷貝。根據mRNA分子3’-末端序列末端結構的分析可以看到，在這段poly(A)序列起點堿基之前的一個堿基，除了為A的情況之外，只能有C、G、T三種可能。根據這種序列結構特征，P. Peng等人設計合成三中不同的下游引物，它由11個或12個連續的脫氧核苷酸加上一個3’-末端錨定脫氧核苷酸組成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個mRNA群體在cDNA水平上分成三個亞群體。然后用一個上游的隨機引物和與反轉錄時相同的oligo(dT)引物對這個cDNA亞群體進行pcr擴增，因為這個上游的引物將隨機結合在cDNA上 ,因此來自不同mRNA的擴增產物的大小是不同的，可以在測序膠上明顯分辨開來，從而篩選出不同樣品間基因差異表達的DNA片段（如圖1）。
隨著mRNA差異顯示技術的廣泛應用，也逐漸顯露出一些不足之處，如所得特異性cDNA片段克隆的假陽性的比例較高，差異條帶分離困難，獲得的差異擴增片段一般在100bp~600bp太短之間，包含大量的非編碼序列，不利于同源性比較分析等。
以下是以紅豆杉為例進行mRNA差異顯示研究的具體操作。
請輸入賬號
請輸入密碼
請輸驗證碼
以上信息由企業自行提供，信息內容的真實性、準確性和合法性由相關企業負責，環保在線對此不承擔任何保證責任。
溫馨提示：為規避購買風險，建議您在購買產品前務必確認供應商資質及產品質量。
