目的

對于許多重組DNA的實驗，知道DNA的序列常是進一步操作所*的。 本實驗將定出你所選殖之cDNA的序列，并進行數據庫比對分析。其目的在教導學生如何從事DNA定序分析及DNA序列的計算機分析。

原理

本實驗所使用之方法為F. Sanger所發展之dideoxy定序法。 此法乃是將一引子黏合到欲定序之DNA模板上，再利用DNA聚合脢行聚合反應，直到加入一dideoxyribonucleoside triphosphate (ddNTP)而中斷。 每一定序分析須執行四組反應，每一反應含有所有四種deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP)及*之一種ddNTP。 由于ddNTP缺少核酸鏈聚合所需之3’-OH基，四組反應中的核酸鏈將會分別停在A、 G、 C或T。 dNTP和ddNTP的相對濃度可調整至所產生中斷鏈的長度范圍從數十到數百個核甘酸。然后，利用高解析力之定序膠體電泳將四組反應產生之dna片段依長度大小分開，即可讀出DNA序列。

材料

• RNAse A：10 mg/ml水溶液。

• 30% polyethylene glycol (PEG) 6000/1.5 M NaCl

• 2 M NaOH/2 mM EDTA

• 3M sodium Acetate (pH 5.3)

• 下列試劑來自United States Biochemical公司所售之Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit：

o Sequenase Reaction Buffer (5X concentrate)：200 mM Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM MgCl2，250 mM NaCl

o pUC/M13 forward (-47) primer： 5"-d(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3"

o 四種Termination Mix： 均含50 mM NaCl，80 ?M dATP，80 ?M dGTP，80 ?M dCTP，80 ?M dTTP，并各含8 ?M ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP

o 0.1 M dithiothreitol(DTT)

o Labeling Mix (5X concentrate)： 7.5 ?M dGTP，7.5 ?M dCTP，7.5 ?M dTTP

o Enzyme Dilution Buffer：10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，5 mM DTT，0.5 mg/ml BSA

o Sequenase Version 2.0 T7 DNA polymerase：13 units/?l in 20 mM KPO4 (pH7.4)，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% glycerol

o Stop Solution： 95% formamide，20 mM EDTA，0.05% bromophenol blue，0.05% xylene cyanol FF

• 10 mCi/ml [35S]dATP：購自Amersham公司

• 40% acrylamide/bis-acrylamide(19:1)溶液

• urea

• 10X TBE buffer：890 Mm Tris-borate，890 mM boric acid，20 mM EDTA

• 10% ammonium persulfate

• TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine)