（1）將抗原共價結合到固相支持物上zui簡單的方法，是將抗原結合到活化的微球上。現有商家提供各種不同的支持物。這些活化的基質的應用將于第九章討論。如果必須使用這些基質，首先推薦使用有彈性空間臂的基質。它能保證結合抗原的活性位點與微球自身之間合適的距離。
如果使用多肽抗原，應將抗原直接連接到活化微球上。
如果使用多肽抗原，將其直接連接到微球上，而不是將它先連接到一載體分子上。如果合成肽在其一端有自由氨基或羧基基團，通過此基團將肽直接連接到微球上。在個別情況下，合成肽不具有這些基團，這種肽應通過與制備抗原相同的方式將它們連接到載體分子上。這些載體分子必須不同于那些用于免疫的載體分子（例如可以用BSA—肽純化針對KLH—肽產生的抗體）。否則，針對載體分子的抗體也將被純化。盡管任何分子在理論上都能用作載體，但建議純化抗體時的載體選用與制備抗體時使用的載體類似的大分子蛋白質。
抗體樣本的緩沖液中不能有外源性的化合物，它們能與活化微球的反應基團結合。zui常見的結合過程是針對抗體上的氨基基團（或琉基，如果用氯化甲苯磺酰）。如果在抗體純化時已用過這些化合物，抗體樣本應用0．5mol／L磷酸鈉結合緩沖液（pH7．5）充分透析。
（2）用0．5mol／L的磷酸鈉溶液（pH7．5）制備抗原溶液。留小量樣品以檢測結合率（將在第5步中進行）。待結合的抗原量依不同的實驗而異。在多數情況下，10mg的抗原加到lml的微球上將得到高容量柱。
同所有蛋白質溶液一樣，應避免過度的機械作用或與空氣接觸以盡量避免蛋白變性。
（3）加入根據廠家推薦的方法準備好的活化微球。
（4）用搖床在室溫下輕柔混勻2h或4℃過夜。
（5）用0．5mol／l磷酸鈉溶液（pH7．5）洗滌微球2次，收集過夜結合的上清液。比較緩沖液中前后蛋白的含量。如果抗原有*、*或苯*殘基，可比較其280nm處的吸光度值。也可用考馬斯亮藍染SDS-PAGE后的條帶。
（6）用lmol／L氯化鈉溶液和0．05mol／L磷酸鈉溶液（pH7．5）洗滌微球一次。
（7）加入10倍體積的100mol／L乙醇胺（pH7．5），室溫下孵育4h或4℃過夜，輕輕搖勻。
（8）PBS洗2次。
（9）將結合有抗原的微球裝柱。有些結合的抗原可能在洗脫抗體時亦被洗脫，預洗滌時，去除這些抗原非常重要。在本例中，抗體即能在低pH值，又能在高pH值時釋放出來，所以要用這些緩沖液對抗原柱進行預洗滌。
先用10倍微球體積的10mmol兒Tris（pH7．5）溶液洗柱，再用10倍微球體積的100mmol／L*（pH2．5）洗滌，然后用10倍體積的10mmol／L Tris（pH8．8）洗脫。檢測zui后出柱的Tris洗液的pH值。如果不是8．8，繼續洗滌。接著加入10倍體積100mm01／L三乙胺（pHil．5，新鮮配制）。用10mmol／LTris洗滌直至洗液的pH值達到7．5為止。
（10）將多克隆血清過柱，使抗體與柱上的抗原結合。血清上柱前應無任何沉淀，如果有，應通過離心或用蛋白A或蛋白G色譜柱（見前）純化抗體，以便除去沉淀。如果樣品是血清，上柱前用10mmol／LTris（pH7．5）將血清以1：10稀釋。抗體溶液過柱時應用蠕動泵使其以低流速過柱。
使用高pH和低pH溶液洗脫，只能洗脫出一部分結合到柱上的抗體。一些高親合力抗體在這些條件下仍不能被洗脫，因此zui終將導致抗體結合容量降低。如果遇到這種情況，又不能得到新層析柱，可以用更苛刻的試劑洗脫，如1．5mol／L硫氰酸鉀、4mol／L尿素或3．5mol幾氯化鎂，它們可能使層析柱再生，用來制備有用的抗體，但取決于抗體的性質。
（11）用20倍微球體積的10mmol／LTris（pH7．5）洗滌柱，然后用20倍體積的500mmol／L氯化鈉，10mmol／LTris（pH7．5）依次洗脫。
（12）通過用10倍體積100 mmol／L*溶液（pH2．5）過柱，可以洗脫對酸敏感的抗體。將洗脫液收集在盛有1倍微球體積的1mol／LTris溶液（pH8．0）中。
（13）用10mmol／LTris（pH8．0）洗滌柱，直至pH值升至8．8。
（14）通過用10倍體積100mmol／L三乙胺溶液（pHll．5，新鮮配制）過柱，可以洗脫對堿敏感的抗體。將洗脫液收集在盛有1倍微球體積的lmol／LTris溶液（pH8．0）中。
（15）用10mmol／LTris（pH7．5）洗滌柱，直至其pH為7．5。將柱子存放于含0．01％柳硫汞的緩沖液中，以便以后重新使用。
（16）將各抗體溶液混合，并用含0．02％氯化鈉的PBS溶液透析。如果有必要，通過蛋白A或蛋白G柱濃縮抗體。