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間隙連接蛋白45抗體說明書,CX45抗體價(jià)格

時(shí)間:2013-2-25閱讀:329
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間隙連接蛋白45抗體說明書,CX45抗體價(jià)格

 

注意:當(dāng)在組織培養(yǎng)板中進(jìn)行不同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染時(shí),轉(zhuǎn)染試劑和siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的用量需要與不同孔的表面積成比率。

 

1,準(zhǔn)備以下混合物:

 

(A)加1.8ul的10um siRNA到20ul 的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中,輕柔混合,在室溫放置5分鐘  注意:如果需要低濃度的siRNA,用siRNA稀釋緩沖液稀釋

 

(B) 加1.2ul siRNA轉(zhuǎn)染試劑到20ul siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中,輕柔混合,室溫放置5分鐘。注意:雖然,對多種的細(xì)胞系有很高的轉(zhuǎn)染效率,但siRAN轉(zhuǎn)染試劑并不是對所有細(xì)胞都適合。

 

2,5分鐘后,混合A和B,形成siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物,輕柔混合,室溫孵育20分鐘。

 

3,孵育后,加160ul siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基到每個(gè)含有siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的管中,輕柔混合

 

  從這一步起,對懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的處理方法相同

 

4,轉(zhuǎn)染前,吸棄培養(yǎng)基,用0.3ml無菌siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次,去除培養(yǎng)基。

 

5,在洗過的細(xì)胞上,鋪稀釋的siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物,37度,5-7小時(shí)

 

6,孵育后,向含有轉(zhuǎn)染細(xì)胞的每個(gè)孔中加200ul 生長培養(yǎng)基,其中的血清和抗生素濃度是正常濃度的兩倍,無需去除轉(zhuǎn)染混合物。如果,毒性是個(gè)問題的話,去除轉(zhuǎn)染混合物,以正常生長培養(yǎng)基代替。再孵育18-24小時(shí)

 

7,孵育結(jié)束后,用新鮮正常生長培養(yǎng)基替換,繼續(xù)孵育24-72小時(shí)

 

8,使用恰當(dāng)?shù)牟僮鞑襟E檢測細(xì)胞,參見免疫熒光染色步驟

染色質(zhì)免疫沉淀間隙連接蛋白45抗體說明書,CX45抗體價(jià)格

 

 

 
 

注意:CHIP的實(shí)驗(yàn)步驟可以有很多不同版本,下面介紹的步驟適合大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)

 

常溫下,用PBS洗細(xì)胞,重懸細(xì)胞,使細(xì)胞數(shù)大約5*105個(gè)/ml(總細(xì)胞數(shù)2*107)。,

 

加甲醛,使終濃度為1%,室溫孵育10分鐘。

 

加*至終濃度0.125M,終止交聯(lián)反應(yīng)

 

2000rpm,5分鐘,離心細(xì)胞。用冷的PBS洗細(xì)胞一次

 

用6ml的裂解緩沖液重懸細(xì)胞,輕柔混合,2000rpm離心5分鐘,收集粗提的核提取物。

 

再用PBS洗沉淀,沉淀可以凍存,或繼續(xù)以下步驟。

 

用1.9ml的高鹽裂解緩沖液重懸沉淀,轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中準(zhǔn)備超聲

 

超聲條件需要優(yōu)化,下面介紹的條件是在使用Sonics VC130和3mm的探頭的基礎(chǔ)上建立起來的:

 

在冰上操作,輸出功率設(shè)置5(R)6,每隔30秒超聲一次,共4次。

 

4°C,10,000rpm 離心15分鐘,保存上清,確定上清中蛋白的濃度。

 

如果免疫沉淀,我們推薦100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz試劑(0.2—2ug)

 

注意:研究者可能希望使用連接有葡聚糖或磁珠的一抗,以便于選擇后續(xù)免疫沉淀的試劑。有些情況下,將針對同一種蛋白不同表位的抗體聯(lián)合使用會(huì)更好。

 

向染色質(zhì)溶液加50ul Protein A/G-瓊脂糖,4度,孵育30分鐘,使其澄清,zui大速度,4度離心5分鐘。

 

向上清中加一抗,4度孵育過夜。

 

加50ul Protein A/G –瓊脂糖,4度孵育2小時(shí)。

 

12,000rpm離心20秒收獲磁珠,并將管放在冰上

 

用1ml裂解緩沖液洗磁珠2次

 

用沖洗緩沖液洗磁珠四次

 

重懸磁珠在400ul洗脫緩沖液中

 

通過在67度水浴中孵育管子2小時(shí)以上,使反向交叉連接

 

離心去除磁珠,繼續(xù)在67度水浴孵育上清過夜 Remove

 

10,000rpm離心3分鐘去除殘留的珠子,保留上清

 

分離DNA,用500ul 酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提上清,劇烈振蕩,14,000rpm離心3分鐘分離兩相。

 

保留水相,用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE)  反向抽提有機(jī)相一次,在匯集水相

 

用600ul 氯仿/異戊醇抽提匯集的水相

 

DNA可以用商業(yè)化的試劑盒濃縮。

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