細(xì)菌工程菌在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)主要分為兩種形式，一種是在強(qiáng)啟動(dòng)子條件下的高效表達(dá)，由于蛋白質(zhì)的過度表達(dá)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)立即高效不折疊而發(fā)生不規(guī)則卷曲，以固體顆粒形式堆積在細(xì)胞間質(zhì)中。這稱為包涵體，另一種為間質(zhì)內(nèi)可溶性表達(dá)，即折疊正常，具有生物活性。一般來說，只要細(xì)菌正常破壁，就可以離心分離的形式分離包涵體和可溶性表達(dá)蛋白。

　　大腸桿菌用于提取表達(dá)外源蛋白，在超聲波破碎儀使用前，用含1%triton-X-100的PBS懸浮，然后破碎是有效的。1%triton-X-100的作用仍然明顯，對其他幾種細(xì)菌也有同樣的作用。例如鏈霉菌等。

　　細(xì)菌沉淀直接加入樣品1buffer，再加入5l巰基乙醇，充分混合，離心分離，煮沸10min，直接裝樣品。染色脫色工序如下：道。將膠水放入適量染色液微波爐加熱1min(下次適當(dāng)補(bǔ)充乙酸即可)，染色液大量清水(自來水即可)，微波爐煮10min即可。表達(dá)重組蛋白后，超聲破碎細(xì)胞，采用冰浴，破400w、2s終止1s，但很快產(chǎn)生大量泡沫，影響破碎功率。pbs和tris緩沖液均如此，zui后破碎不，但我的目的蛋白在這些未破碎的細(xì)胞中。
　　1、之所以會產(chǎn)生氣泡，是因?yàn)槟愕奶结樜恢脹]有到位。超聲波破碎機(jī)的探頭必須靠近底部，約1cm(推薦距離底部0.5mm)。電力因機(jī)器而異，觀察液面，雖然有變動(dòng)，但請不要太激烈。
　　2、打碎3S10S，破碎20-30個(gè)循環(huán)觀察效果。
　　3、還要注意探頭的定位，如果聽錯(cuò)了就要及時(shí)調(diào)整。另外，可以從菌濃度方面考慮。用超聲波破碎時(shí)，請嘗試增大體積，使振幅不超過60%。
　　試著超過4、8s停止8s，對部分菌體蛋白來說，常規(guī)方法不易退熱，蛋白變性產(chǎn)生氣泡，停止時(shí)間稍長為宜。這多見于包涵體形式的蛋白質(zhì)。更換Branson超聲波破碎機(jī)進(jìn)行作業(yè)，由于耗電量少，可以適當(dāng)縮短休眠時(shí)間。
　　二、幾個(gè)需要注意的問題：
　　1、蛋白以包涵體形式表達(dá)，要求高破碎率，細(xì)胞碎片小，而另一蛋白以可溶形式表達(dá)，細(xì)胞碎片不能小。兩種情況要求不同，但目的相同，均便于后期固液分離。
　　2、超聲波中出現(xiàn)黑色沉淀物，說明超聲波功率太強(qiáng)。3、超聲時(shí)間過長，功率過高肯定會影響蛋白活性。

　　4、盡量防止泡沫的產(chǎn)生。