96孔板測(cè)定示例

概述

添加適當(dāng)?shù)膶?duì)照或測(cè)試樣品（50μL）

預(yù)孵育10-15分鐘

添加MMP Green 底物溶液（50μL）

孵育0分鐘（用于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)）或30分鐘至1小時(shí)（終點(diǎn)讀數(shù)）

在Ex / Em = 490/525 nm處監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度

注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍所有試劑盒組分。

操作方法

1.根據(jù)需要制備含有生物樣品的MMP。

2.pro-MMPs：

2.1制備2mM APMA工作溶液（2X）：用1：500稀釋1M APMA（組分B）和測(cè)定緩沖液（組分C），得到2mM APMA工作溶液（2X）。

注意：APMA屬于有機(jī)汞。 小心輕放！ 根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處理。

2.2用APMA包埋MMPs：用等體積的2mM APMA工作溶液（2X，來(lái)自步驟2.1）孵育含有MMP的樣品或純化的MMPs。 有關(guān)孵育時(shí)間，請(qǐng)參閱說(shuō)明書中的附錄I. 在實(shí)驗(yàn)之前立即MMP。

注意1：將含酶樣品保存在冰上。 避免劇烈渦旋酶。長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存活化酶會(huì)使酶失活。

注意2：對(duì)于酶活化，優(yōu)選在較高蛋白質(zhì)濃度下活化。后，您可以進(jìn)一步稀釋酶。

3.準(zhǔn)備工作解決方案：

3.1制備MMP Green 底物工作溶液：用1：100稀釋MMP Green 底物（組分A）和測(cè)定緩沖液（組分C），如說(shuō)明書中表1所示。

3.2制備MMP稀釋：如果使用純化的MMP，則在測(cè)定緩沖液（組分C）中將MMP稀釋至合適的濃度。

注意：Pro-MMP需要在使用前（參見步驟2.2）。 避免劇烈渦旋酶。

3.3制備抑制劑和化合物稀釋：如果您正在篩選MMPs抑制劑，請(qǐng)根據(jù)需要稀釋已知的MMPs抑制劑和測(cè)試化合物。

4.根據(jù)說(shuō)明書中的表2和表3在96孔微孔板中建立酶促反應(yīng)：

5.運(yùn)行酶反應(yīng)：

5.1如果您正在篩選MMPs抑制劑，則將培養(yǎng)板在酶反應(yīng)（例如25°C或37°C）的所需溫度下預(yù)孵育10-15分鐘。

5.2將50μL（96孔）或20μL（384孔）MMP Green 底物溶液（來(lái)自步驟3.1）加入到測(cè)定板的樣品和對(duì)照孔中。充分混合試劑。

5.3用Ex / Em = 490 / 525nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

動(dòng)態(tài)讀數(shù)：立即開始測(cè)量熒光強(qiáng)度，每5分鐘連續(xù)記錄數(shù)據(jù)30至60分鐘。

終點(diǎn)讀數(shù)：在室溫下孵育反應(yīng)30至60分鐘，如果可能，避免光照。 充分混合試劑，然后測(cè)量熒光強(qiáng)度。