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TUNEL（熒光）檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
項(xiàng)目編號(hào) | 項(xiàng)目名稱 | 單價(jià) | 備注 |
ZC1077 | TUNEL（熒光） | 張 | 200元 |
服務(wù)介紹：
晚期凋亡細(xì)胞中染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂產(chǎn)生粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化下，將帶有熒光素分子的dUTP標(biāo)記到DNA的3'-末端，然后通過(guò)熒光顯微鏡觀察、或進(jìn)而用帶有HRP的一抗染色后DAB顯色，可以進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，該實(shí)驗(yàn)稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：
實(shí)驗(yàn)流程：
冰凍切片tunel實(shí)驗(yàn)步驟：
1、 冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來(lái)復(fù)溫，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮*干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
2、 修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲(chǔ)存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
3、 破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
4、 加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合（試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn)用），加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫孵育2小時(shí)，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
5、 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片放入用甲醇配制的3%（過(guò)氧化氫：甲醇=1:9）室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
6、 加試劑3：切片稍甩干后，每張切片加適量試劑3(converter-POD）覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
7、 DAB顯色：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為細(xì)胞核呈棕黃色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。
8、 復(fù)染細(xì)胞核：Harris蘇木素復(fù)染3min左右，自來(lái)水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。
9、 脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --無(wú)水乙醇Ⅰ6min -無(wú)水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹膠封片。
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