GST Magnetic Beads

產(chǎn)品介紹：
GST Magnetic Beads 是1μm大小均勻的，表面包覆有高密度谷胱的二氧化硅基質(zhì)超順磁磁珠。這種磁珠是特定設(shè)計主要用于免疫沉淀反應(yīng)，或者快速，一步法純化帶有 GST-標(biāo)簽的重組蛋白，純化過程大約需要15-25分鐘。

產(chǎn)品特點：

·快捷，簡單的一步法高通量操作，無需純化柱或過濾器，或重復(fù)移液、離心等操作（圖 1）

·高結(jié)合能力

·極低的非特異性結(jié)合率

·成本低：只有市場同類磁珠產(chǎn)品價格的一半

·對樣本體積要求低，便于自動化操作


緩沖液成分：
·GST Magnetic Beads (懸浮在 0.05 M Na2HPO4, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.01% NaN3 緩沖液
中)
·1x Binding/Washing Buffer (0.14 M NaCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, pH 7.5)
·1x Elution Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)
注意事項: Dissolve 100 mg Glutathione (reduced) in 10 ml of 1x Elution Buffer. Prepare fresh. ·PBS Buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.5)
所需耗材
磁力分離器（適用于手動操作）：根據(jù)實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同
型號的磁力分離器：本公司 CZ402-01 可以容納 8 個單獨的 1.5 ml 離心管; CZ402-02 可
以容納 24 個單獨的 1.5 ml 離心管; CZ402-03 和 96 孔深孔板配合使用; CZ402-04 可以容
納 4 個單獨的 15 ml 離心管; CZ402-05 可以容納 4 個單獨的 50 ml 離心管。
操作過程
注意事項：
設(shè)計一個用于純化 DNA 或 RNA 的通用操作流程相對簡單，因為核酸具有相對一致
的生化特性。然而，設(shè)計一個用于蛋白質(zhì)純化的通用試劑盒是非常困難的，因為每種蛋白
質(zhì)具有不同的組成和結(jié)構(gòu)。為了獲得實驗結(jié)果，每個用戶必須確定需要純化的融合蛋
白的純化條件。
在純化 GST 標(biāo)記的融合蛋白之前，應(yīng)將所需使用的試劑溫度調(diào)劑到室溫。
A．細(xì)胞提取物的制備去除上清后收集細(xì)胞體，并在-80℃下冷凍
放置 1 小時。
2. 在冰塊上解凍細(xì)胞，并且每 50 毫升細(xì)胞培養(yǎng)物用 3ml 的 1x Binding/ Washing Buffer 重
新懸浮細(xì)胞。在冰上通過短暫的超聲破碎細(xì)胞，直到樣品不再粘稠。同時避免樣品被加熱。
注意：GST 標(biāo)簽與磁珠的結(jié)合不受 1% Triton X-100、1% Tween-20、1% CTAB、10 mM DTT、
0.03%SDS 或 0.1% NP-40 的影響。而且，這些化學(xué)物質(zhì)可能會減少非特異性結(jié)合概率。
3. 以 10000 x g 離心6分鐘，小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的預(yù)冷管中，并將沉淀按照每50ml
培養(yǎng)物加入 3ml 1x Binding /Wshing 緩沖液方式重新懸浮。
4. 分別從上清液和沉淀液中吸取 10μl 樣品，加入等體積的 2x SDS 加樣緩沖液， 煮沸 5
分鐘，使用 SDS-PAGE 測定融合蛋白的總量和溶解度。
注意：如果 GST 融合蛋白形成包涵體（不溶性蛋白），則包涵體必須在純化前適當(dāng)溶解和
重新折疊。
B．在自然條件下純化重組 GST 標(biāo)簽融合蛋白
1. 震蕩裝有磁珠的試劑瓶，直到磁珠懸浮，然后將適量的磁珠轉(zhuǎn)移到新的試管中。
注意：這一點非常重要，用戶應(yīng)根據(jù)粗樣品中 GST 標(biāo)記融合蛋白的數(shù)量，根據(jù)經(jīng)驗確定
用于每次純化的磁珠數(shù)量。過多的磁珠會導(dǎo)致更高的背景；磁珠太少會導(dǎo)致產(chǎn)量下降。
所以，我們建議從每 0.1mg 重組 GST 標(biāo)簽融合蛋白加 100μl 懸浮磁珠開始純化。
2. 將試管置于磁力分離器中，等待 2-3 分鐘，直到上清液澄清。吸出上清液，從磁力
分離器上取下管，用 4 倍體積的 1x Binding /Wshing 緩沖液重新懸浮磁珠。
3.重復(fù)步驟 2 一次。
4. 將試管放入磁力分離器中，待上清液澄清后丟棄上清液。用 1 倍體積的 1xBinding
/Wshing 緩沖液重新懸浮磁珠。
5. 將制備好的細(xì)胞提取物與磁珠混合，通過多次顛倒充分混合，并在連續(xù)旋轉(zhuǎn)的情況下混
勻 10-20 分鐘。將試管放入磁力分離器中，保存一小部分上清液并丟棄剩余部分。
注意：保留一份上清液供進(jìn)一步分析，因為某些蛋白質(zhì)可能不會與磁珠結(jié)合。
6. 通過添加 8 倍體積的 1x Binding /Wshing 緩沖液清洗磁珠，并通過移液器多次吹吸重新
懸浮磁珠。再次將試管放入磁力分離器中，然后吸出試管上清液。
7. 用 8 倍體積的 1x Binding /Wshing 緩沖液充分清洗磁珠，直到洗脫液在 280 nm 處的
吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。（注意：這一步對于獲得高純度蛋白質(zhì)非常重要。）
8. 從磁力分離器上取下試管，向試管中加入所需體積的 1x Elution Buffer 緩沖液，從磁珠
上洗脫下結(jié)合蛋白。通過多次吹吸，將磁珠重新充分懸浮，并在室溫下渦旋震蕩 5 分鐘充
分混勻。將管放入磁力分離器中，小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。
9.重復(fù)步驟 8 一次。
10. 分別從上述步驟5 中吸取的上清液和步驟 8 中吸取的蛋白洗脫液中吸取 10-20μl 液體，
并進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，以確認(rèn)目標(biāo)蛋白的存在。
C．磁珠的再生和儲存
注意：如果目標(biāo) GST 融合蛋白相同，則磁珠可重復(fù)使用三次而無需再生。但是，如果目
標(biāo) GST 融合蛋白不同或磁珠結(jié)合能力下降，則必須根據(jù)以下條件再生磁珠：
1. 使用 10 倍體積的再生緩沖液 I (50 mM Tris-HCl，pH 8.0, 0.5 M NaCl)清洗磁珠，并用上
述的磁力分離器分離上清液。
2. 使用 10 倍體積的再生緩沖液 II (100 mM 醋酸鈉，pH 4.5, 0.5 M NaCl)清洗磁珠，并用
磁力分離器分離上清液。
3. 通過添加 10 倍體積的 1x Binding /Wshing 緩沖液，快速平衡磁珠。對于長期儲存，磁
珠應(yīng)儲存在 4oC 的 20%乙醇中。
D．常見問題
問題 1：純化的融合蛋白產(chǎn)率低或無法檢測到。
可能原因：
1. 重組蛋白形成包涵體
建議： ⑴在 14℃環(huán)境培養(yǎng)菌體。
⑵將 IPTG 的最終濃度降低至 0.1mM 以進(jìn)行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)。 ⑶減少蛋白誘導(dǎo)時間。 ⑷純化前正確破碎包涵體。
2. 該融合蛋白不含有活性 GST 標(biāo)簽
建議：嘗試使用其他融合蛋白的純化方式，例如 His 標(biāo)簽。重新編碼目標(biāo)蛋白的純化標(biāo)簽。
3.過度的超聲破碎，使蛋白變性。 建議：盡量使用溫和的超聲波條件或其他方法。
4.融合蛋白不與磁珠結(jié)合
建議： ⑴在細(xì)胞裂解之前，在結(jié)合緩沖液中添加最終濃度為 5 mM 的 DTT。 ⑵ 檢查結(jié)合緩沖液的 pH 值（pH 值應(yīng)為 6.5-8.0）。
5. 融合蛋白不能有效地從磁珠中洗脫。
建議： ⑴提高洗脫時間。 ⑵將洗脫緩沖液中的谷胱肽濃度增加至 15mM 或更高。（請檢查最終 pH 值，必要時進(jìn)行調(diào)整。）
⑶在不增加谷胱肽濃度的情況下，將洗脫緩沖液的 pH 值調(diào)整至 8.0-9.0。 ⑷在洗脫緩沖液中添加最終濃度為 0.1% Triton X-100 或最終濃度為 0.1-0.2 M NaCl。
問題 2. 在洗脫蛋白中觀察到多條帶可能原因：
1.融合蛋白降解
建議： ⑴添加適量的蛋白酶抑制劑。 ⑵使用蛋白酶缺陷表達(dá)宿主。
2. 一些宿主蛋白，如伴侶蛋白，可能與融合蛋白相互作用。
建議： ⑴在洗脫緩沖液中加入最終濃度為 5 mM DTT。 ⑵純化前，在 37℃下將重組蛋白溶液在伴侶蛋白緩沖液（2 mM ATP、10 mM MgSO4、50 mM Tris-HCl）中溫浴 10 min。
3. 過度超聲處理會導(dǎo)致一些蛋白質(zhì)與融合蛋白結(jié)合。
建議：使用溫和的超聲條件或其他溶解方法。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。