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貨號 | XG-P2771 | 規格 | 1ml(30mg/ml) |
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包裝 | 盒裝 | 用途 | 僅供科研研究實驗 |
NHS活化磁珠
貨號 | 規格 | 分類 |
XG-P2771 | 1ml(30mg/ml) | 核酸純化 |
NHS-Activated Magnetic Beads 是均勻的,表面覆蓋有高密度NHS(N-羥基琥珀 酰亞胺) 官能團的磁珠。磁珠通過形成穩定的酰胺鍵方式,快速、高效的共價結合任何含有伯胺的配 體(圖 1)。本款磁珠可以在偶聯條件下快速完成反應(室溫 pH 6.5-9 下 15-30 分 鐘,4℃ 下 4 小時),且不需要危險化學品。 NHS-activated Magnetic Beads 適于結合大分子蛋白。 Long-arm NHS-activated Magnetic Beads 被推薦用于結合小肽分子, 因為其長臂(21-原子) 的親水連接基團可以減少位阻現象。 NHS-activated Magnetic Beads 可以地作為親和樹脂進行親和純化,將分子、 細胞和 部分細胞提取物進行提煉純化。在與配體結合后,將磁珠添加到含有目標分子的樣品中,然 后混合、孵育、洗滌和洗脫目標分子(圖2)。
產品特點及優勢:
·預活化即用型磁珠
·便于使用
·在pH7.4,4℃-25℃條件下可以快速偶聯
·穩定的共價鍵,低水平的配體泄漏
·可重復使用的免疫親和基質
·極低的非特異性結合率
·用途:用于純化抗體,蛋白質/肽,DNA / RNA;細胞篩選、免疫沉淀
操作步驟
提示:
強烈建議在實驗過程中進行滴定優化,以確定每個實驗中應用的磁珠數量。該協議可以相應地放大和縮小。避免使用含有 tris 或其他含有伯胺類試劑的緩沖液,因為它們與預期的偶聯反應競爭。
1.將適量的珠子轉移到離心管中。將管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當磁珠沉淀時, 去除上清液。
2.取下試管,加入 5 倍磁珠溶液體積的 PBS 緩沖液,通過震蕩重新懸浮磁珠,渦旋 30 秒。將試管至于室溫環境 1-3 分鐘,再將管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當磁珠沉淀 時,去除上清液。
3.重復步驟 2 兩次。
4.向含有目標蛋白質的粗樣品中添加洗滌過的磁珠,并在室溫或所需溫度下溫浴 1-2 小時 (溫度越低,培養時間越長)。提示:強烈建議進行滴定實驗以優化培養時間。因為孵化 的時間太長可能會導致很高的背景。
5.用 5 倍磁珠體積的 PBS 緩沖液或 1M NaCl 清洗磁珠,直到 280nm 處洗脫液的吸 光度接近背景水平(OD 280<0.05)。提示:添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也 可能會降低非特異性背景。例如,向洗滌緩沖液中添加 NaCl(濃度為 1-1.5 M)、0.1-0.5% 的非離子洗滌劑,如 TritonX-100 或 Tween-20,以及還原劑,如 DTT 或 TCEP(我們通 常使用 3mM)。 6.通過適當的方法,如低 pH(2-4)、高 pH(10-12)、高鹽、高溫、親和洗脫或 SDS-PAGE 上樣緩沖液中煮沸,洗脫目標蛋白。
一、模板DNA:PCR反應需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;
二、引物:PCR反應的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;
三、dNTPs:PCR反應中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成 等生物學過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;
四、Taq DNA聚合酶:PCR反應需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;
五、PCR buffer溶液:對PCR反應具有緩沖作用,調節反應pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應特異性,從而提高反應效率;
六、酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟,常常需要進行酶切操作。
七、MARK:一種分子量標準,用來判別DNA片段大小的工具。
八、DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應產物;
①Oligo dT
選擇Oligo dT時,要求RNA必須有Poly A,所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT,對RNA樣品的質量要求較高,不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應,建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT,尤其適合模板豐度很低的情況(比如某個gene表達量很低)。選擇隨機引物時,鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板,然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系,一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng,如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng,可能會導致小片段產物(<500bp)的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物(GSP)是某個基因序列的一部分,與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合,每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此,當分析多種目標時,則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同,所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物,建議對退火溫度進行優化。
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