Bst 3.0 DNA/RNA polymerase

儲(chǔ)存條件：-20℃保存
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
Bst 3.0 DNA/RNA 聚合酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）DNA 聚合酶 I 大片段（Bst LF）經(jīng)過(guò)基因突變改造
過(guò)的聚合酶。該酶具有 5’-3’的 DNA 聚合酶活性和鏈置換活性，無(wú) 5’-3’核酸外切酶活性。與 Bst 2.0 DNA/RNA 聚合酶相比，Bst 3.0DNA/RNA 聚合酶的熱穩(wěn)定性、擴(kuò)增速度、鏈置換速度和逆轉(zhuǎn)錄活性有了進(jìn)一步的提升。適合高溫快速 LAMP 類(lèi)型的等溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)。
活性單位： 一個(gè)活力單位（1 U）即在 65°C 條件下，30 分鐘內(nèi)催化 25 nmol dNTP 的摻入反應(yīng)成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量。
質(zhì)量控制：SDS-PAGE 檢測(cè)純度大于 99%，經(jīng)檢測(cè)無(wú)核酸外切酶，內(nèi)切酶活性，無(wú)細(xì)菌基因組 DNA 殘留。通過(guò)各種模板進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增測(cè)試。室溫存放一周，無(wú)明顯活性改變。
應(yīng)用范圍：
1.DNA 或 RNA 為模板的 LAMP 等溫?cái)U(kuò)增。
2.適用于鏈置換方法擴(kuò)增 DNA。
3.高 GC 結(jié)構(gòu) DNA 的測(cè)序和微量 DNA 模板快速測(cè)序。
10×Bst Buffer：200 mM Tris-HCl，100 mM (NH4)2SO4，500 mM KCl，80mM MgSO4，1% Tween® 20
pH 8.8@ 25°C
儲(chǔ)存緩沖液：10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% Glycerol，0.1% Triton
® X-100，pH 7.5 @ 25°C
使用方法：

1. 按以下組分配制 LAMP 等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，建立反應(yīng)體系。

2. 混勻，離心數(shù)秒，置于控溫設(shè)備中 65℃反應(yīng) 30-60min。
3. 反應(yīng)結(jié)束后 85℃，5min 失活聚合酶。電泳檢測(cè)或肉眼觀察并記錄結(jié)果。
注意：
1.Primer Mix(10×)配制方法，用滅菌水將引物全部溶解至濃度為 100µM 的儲(chǔ)存液。取一干凈離心管，先加 56 μL 滅菌水，然后取FIP 和 BIP 引物各 16 μL, LF 和 LB 各 4 μL，F(xiàn)3/B3 各 2μL，混勻即可。
2.反應(yīng)體系中可以添加 dUTP 和熱敏 UDG 酶。經(jīng)測(cè)試占比 50%的 dUTP（0.7mM）不影響 Bst 酶活性。熱敏 UDG 酶用量可按供應(yīng)商的推薦用量和方法添加。
3.可使用帶熱蓋加熱的 PCR 儀以及金屬加熱塊或恒溫水浴作為控溫設(shè)備。無(wú)熱蓋加熱裝置，需要在反應(yīng)管中添加一滴石蠟油，防止反應(yīng)液蒸發(fā)。
4.可以在反應(yīng)體系中添加適當(dāng)濃度的 SYTO®-9、EvaGreen
® 、SYBR
® Green I 等熒光染料分子，用于實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增。
5.為防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染造成假陽(yáng)性結(jié)果，在其它房間對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行 2%以上濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。