Bst 4.0 Basic Bead

該制品為全體系凍干微球制品，內含恒溫擴增所用的反應緩沖液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，其不包含任何染料，使用時只需要加入引物、模板即可進行核酸恒溫擴增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉錄），還具有依賴于DNA 的聚合酶活性，因此無論 DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進行恒溫擴增。該制品是進行 LAMP 及RT-LAMP 擴增反應的試劑。
本制品不包含任何顯色染料，可自行搭配相關染料或檢測手段進行 LAMP 反應，包括搭配 OG 染料管進行橙綠變色、搭配標記 Oligo 進行試紙條檢測、搭配熒光染料進行熒光檢測、搭配 Molecular Beacon 探針進行熒光檢測等方法。
儲存：-20℃保存 2 年；室溫（25℃）保存>6 個月。
使用方法：（進行 LAMP 橙綠變色擴增）：
1. 關于 OG 橙綠變色管說明：橙綠變色染料（OG Dye）以烘干的形式預加在8聯管蓋上。LAMP反應完畢后，將 0.2ml EP 管顛倒溶解 OG 染料后。LAMP的反應產物將與 OG 染料形成綠色肉眼可見變色反應（陽性），而未擴增的 EP 管為深橙色（陰性）。本試劑管常溫長期保存。
2. 配制變色 LAMP 反應體系
在 OG 染料管（0.2ml EP）反應管中加入下述試劑
Bst4.0 Basic Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、
注意：全部試劑加入完畢后，輕彈 EP 管底部后，再蓋上 OG 橙
3. 反應體系配好后，置于 65°C 進行反應 15~30min。（擴增良好的引物組合，通常 20min 即可變色，一般不超過30min）。
4. 觀察結果：反應結束后，從加熱裝置中將反應管取出，室溫 2min，使整個反應管冷卻下來。再次用力將反應管
注意：
（1）觀察結果時，盡可能不要與配制反應空間共用，以防止污染操作臺。
（2）盡管  選取的為高密封
注意事項：
（1）關于礦物油的使用，在配制完 LAMP 反應體系后，可加入一滴礦物油覆蓋于反應液上部，以減少氣溶膠的污
（2）在使用其它熒光染料時，使用濃度可自行優化，通染料可能導致擴增失敗。
（3）本試劑不支持，濁度、pH 變色、HNB 變色反應，請勿嘗試。
（4）關于 LAMP 成品試劑的建議， Bst 4.0 Basic Bead凍干球和 OG 橙綠變色管均為室溫穩定狀態，可長期保存。將擴增引物加入到 OG 橙綠變色管底部，于 70°C 烘干，再加入一粒凍干球即可制備成全體系檢測試劑。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。