Bst 4.0 Basic Mix (液體預混)

該制品為單一組分的 MasterMix（2 倍濃度），包含了反應緩沖液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，使用時只需要加入引物、模板即可進行核酸恒溫擴增。Bst4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉錄），還具有依賴于 DNA 的聚合酶活性，因此無論DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進行高效的恒溫擴增。該制品是進行 LAMP 及 RT-LAMP 擴增反應的試劑。優(yōu)化的反應體系，確?？焖俚耐瓿蓹z測試劑的反應體系建立。該系列產(chǎn)品不包含任何其它輔助染料，在 LAMP 的擴增搭配 OG 橙綠變色管進行可視化變色反應。除此外，該制品還可以用于其它恒溫擴增實驗，包括 CPA、SMAP 等。
儲存：長期保存制品于-20℃，保存 2 年。
使用實例（以 LAMP OG 橙綠變色為例）橙綠變色染料（OG Dye）以凍干的形式預加在 8 聯(lián)管蓋上。在 LAMP 反應完畢后（在反應完畢前，務
必不能將管蓋上染料混入反應液中），將 0.2ml EP 管顛倒溶解 OG 染料后。LAMP 的反應產(chǎn)物將與 OG 染料形成強烈的綠色肉眼可見變色反應（陽性），而未發(fā)生擴增的 EP管為深橙色（陰性）。
（1）配制反應體系
在 0.2ml EP 反應管中加入下述試劑
2xBst 4.0 Basic Mix 10 μl
*10xLAMP Primer Mix 2 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 20 μl
*10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 4 μM、F3/B3 分別為 2 μM全部試劑加入完畢后，輕彈 EP 管底部后，再蓋上 OG 橙綠變色管（蓋上管蓋后務必不能再劇烈混合與倒置，以防止將管蓋上的 OG 染料溶解，OG 染料一旦混入反應液中將會終止 LAMP 反應）。
實驗 LAMP Primer Mix 分別采用 1、1.5、2 μl，以陰性不變色，陽性樣品正常變色為標準，作為后續(xù)測試用量。
（2）反應體系配好后，置于 60~68°C（實驗采用65°C）進行反應 20~45min。（擴增良好的引物組合，通常 25min 即可變色，一般不超過 45min，實驗設置20、25、30、45min）。
（3）觀察結果：觀察結果時，盡可能不要與配制反應空間共用，以防止污染操作臺。將反應 EP 管倒置，并手腕輕甩，反應液浸泡 EP 管蓋上的 OG 染料，靜置 30s。再將 EP 反應管正置，并輕甩反應液到 EP 管底部，此時擴增樣品將變?yōu)轷r艷肉眼可見綠色，而陰性未發(fā)生擴增的管將為深橙色。
注意事項
1. 在用于其它恒溫擴增反應時（如 CPA、SMAP 等），可參考如上策略進行使用，反應時間可能會需要調整。
2. 關于礦物油的使用，在配制完 LAMP 反應體系后，可加入一滴礦物油覆蓋于反應液上部，以減少氣溶膠的污染。
3. 鑒于特殊的生產(chǎn)工藝， 全系恒溫擴增 Mix 系
列均不能進行濁度分析。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。