蝦堿性磷酸酶（SAP）

描述：

蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，rSAP)催化 DNA 和 RNA 的 5’和 3’磷酸單脂的去磷酸化反應(yīng)。該磷酸酶在分子生物學研究中應(yīng)用廣泛，如去除 DNA 和 RNA末端的磷酸基團，用于后續(xù)的克隆和探針末端標記。在克隆中，可使線性載體去磷酸化，防止自連。蝦堿性磷酸酶在65°C溫育 5 分鐘即可不可逆的失活，因此，在連接或末端標記之后，可以不用去除熱敏磷酸酶。基于以上特性，該酶是傳統(tǒng)去磷酸化酶--小牛腸堿性磷酸酶（CIP）的替代物。

應(yīng)用
DNA 和 RNA 的去磷酸化防止克隆載體的自連制備 5′末端標記模板
儲存：-20℃可保存 2 年。
活性定義：1 單位指在 37°C 條件下，每分鐘水解 1umol 的pNPP（p-Nitrophenyl Phosphate）到 pNP 所需要的酶量。

37°C 孵育 30min。65°C 孵育 5min 進行失活反應(yīng)。
注意：1 pmol 的 5’末端 DNA，相當于 1 μg 的單酶切質(zhì)粒 (3kb 大小)。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。