T4 GP44-62 Clamp loader protein

描述:

T4 噬菌體復制分為依賴于起始子的起始復制和依賴于重組酶的復制。由起始復制產生的 3’-ssDNA 作為重組復制的步鏈侵入的組份，該 3’-ssDNA 被 T4 gp32蛋白所覆蓋，同時將 T4 UvsY 募集到此；T4 UvsY 作為T4 UvsX 的 loader 將其運載至此，于此同時 gp32 被置換下來， UvsX 和 UvsY 形成突觸結構， 然后侵入同源的雙鏈形成 D-Loop， 一旦形成 D-Loop， UvsX 即被置換下來。D-loop 被置換鏈作為滯后鏈合成的模板，很快被gp32 結合。隨后， 解旋酶 loader gp59 與 gp32 覆蓋的DNA 復制叉結合，將 gp41/61 運載至此， gp61 蛋白合成寡核苷酸片段促進滯后鏈 DNA 的合成，而 gp41 通過解旋模板而促進先導鏈的 DNA 合成。最后，聚合酶的滑板蛋白 gp45 和其 loder 蛋白 gp44/62 與先導鏈相結合，促進聚合酶 gp43 的組裝，gp45 將 gp43 運載至復制叉處后啟動先導鏈和滯后鏈的合成，gp44/62 隨后從復制叉處解離。因此，gp44/62 作為 gp45 的 loader 在聚合酶 gp43引導的 DNA 合成中起到重要作用。
儲存：-20℃。
Storage Buffer：
20mM Tris-HCl，pH7.5
200mM NaCl
5mM DTT
25% Glycerol

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。