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AapCas12b 核酸酶(又名 C2c1)是由 tracrRNA:crRNA(或 sgRNA)介導的 DNA 核酸內(nèi)切酶，在靶標雙鏈DNA 存在 PAM (TTN) 序列的情況下，特異地剪切靶標雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。而AapCas12b 特異地剪切單鏈 DNA 靶標不依賴 PAM 序列。此外，雙鏈或單鏈 DNA 靶標均能激活 AapCas12b的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當 AapCas12b 酶與 sgRNA、靶標 DNA 結合形成三元復合物后，便會被激活針對非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。
AapCas12b 來源于嗜酸耐熱菌 Alicyclobacillus acidiphilus，zuijia剪切反應溫度為 60℃，比 AacCas12b(#32116)更耐高溫。因此，相比于 AacCas12b，AapCas12b 更適用于與 LAMP 聯(lián)用，開發(fā)“一步法"恒溫擴增/CRISPR-Cas 檢測體系(詳細信息請參考 PMID: 32937062)。
產(chǎn)品組分
組分 | 32118-01(100 pmol) | 32118-03 (1000 pmol) |
AapCas12b Nuclease (10 μM)a | 100 pmol | 1000 pmol |
10 × HOLMES Buffer 1 | 1 mL | 1 mL |
Control Target DNA and sgRNA b | 5 μL | 5 μL |
a. AapCas12b Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；
b. Control Target DNA and sgRNA 應保存于-80℃并避免反復凍融，必須在 6 個月內(nèi)使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應體系。
保存條件
Control Target DNA and sgRNA 于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運輸。
活性定義
在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應體系中，60℃反應條件下，1 min 內(nèi)剪切 1 pmolssDNA 探針所需的 Cas12b 酶量定義為 1 transU。
例：若某批次 AapCas12b 酶的反式剪切活性為 6.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 AapCas12b
酶可在 1 min 內(nèi)，在上述zhiding的反應條件下，反式剪切 6 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU
數(shù)值詳見各批號的 COA 檢測報告。
實驗流程
1. 順式剪切實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AapCas12b Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
10 μM sgRNA | 0.5 μL | 250 nM |
1 μM Target DNAc | 0.5 μL | 25 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
c. 順式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
l*若用核酸電泳來分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用 dsDNA靶標，因為 ssDNA靶標會被反式激活的 Cas12b 進一步切碎。對于 20 μL 順式剪切應體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長度在 300 bp～3 kb 范圍內(nèi)。不同長度 target DNA需要的 Cas 酶和 sgRNA的量需要根據(jù) target DNA的摩爾量計算，建議保持 Cas 酶:sgRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 targetDNA被剪切wanquan。
60℃反應 30 min~1 h，85℃滅活 5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。
2. 反式剪切實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AapCas12b Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 μM sgRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
1 μM Target DNAd | 0.5~5 μL | 25~250 nM |
10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實驗目的進行調整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，AapCas12b Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長期保存，請使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），sgRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
*反式剪切體系中探針的用量和預期反應到達平臺期的時間可參考各批號Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見本公司提供的 COA檢測報告。
實時熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，60℃反應，每 30 sec 采集一次熒光信號。
實驗結果
注意事項
1. Cas12b 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12b 在 sgRNA 的引導下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶
標需帶有 PAM 位點，而 ssDNA 靶標不依賴 PAM 位點。
2. Cas12b 的反式剪切(trans-cleavage)：當 target DNA 存在時，Cas12b/sgRNA 與 target DNA 形成三元復合物(Cas12b/sgRNA/target DNA)，同時，Cas12b 被激發(fā)反式剪切活性，將反應體系中任意序列的單鏈 DNA
切碎。
3. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進行分子診斷實驗，可參考本公司的 HOLMESv2[1]體系。
4. 為防止 RNase 污染，請保持實驗區(qū)干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。
5. AapCas12b 酶對熱敏感，容易失活，應全程冰上配置反應體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
6. 本產(chǎn)品僅供科研使用。
