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LwaCas13a 核酸酶(又名 C2c2)是依賴于 crRNA 介導(dǎo)的 RNA 內(nèi)切核酸酶，來源于 Leptotrichia wadei 菌株。在靶標(biāo)單鏈 RNA 存在 PFS 序列的情況下，可特異地識別并剪切靶標(biāo) RNA。此外，Cas13a 也具有反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當(dāng) LwaCas13a 蛋白與 crRNA、靶標(biāo) RNA 結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會被激活針對非特異序列單鏈 RNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列單鏈 RNA 切碎。該活性也被用于靶標(biāo)核酸的快速檢測試劑盒的開發(fā)。
產(chǎn)品組分
組分 | 32117-01(100 pmol) | 32117-03(1000 pmol) |
LwaCas13a Nuclease (10 μM)a | 100 pmol | 1000 pmol |
10 × HOLMES Buffer 2 | 1 mL | 1 mL |
Control Target RNA and crRNA (10 μM)b | 5 μL | 5 μL |
ssRNA Reporter (FAM-BHQ1, 10 μM)c | 5 μL | 5 μL |
a. LwaCas13a Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；
b. Control Target RNAand crRNA應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個月內(nèi)使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系；
c. ssRNAReporter(FAM-BHQ1)應(yīng)避光保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個月內(nèi)使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系。
保存條件
Control Target RNA and crRNA 以及 ssRNA Reporter(FAM-BHQ1)于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運輸。
活性定義
在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 2 [pH 7.6]反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)剪切1 pmol ssRNA 探針?biāo)璧?Cas13a 酶量定義為 1 transU。
例：若某批次 LwaCas13a 酶的反式切割活性為 9.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 LwaCas13a酶可在 1 min 內(nèi)，在上述zhiding的反應(yīng)條件下，反式切割 9 pmol ssRNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU數(shù)值詳見各批號的 COA 檢測報告。
實驗流程
1. 反式剪切實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 2 | 2 μL | 1 × |
10 µM LwaCas13a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 µM crRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 µM Target RNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 µM ssRNA Reporter (FAM-BHQ1) | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，LwaCas13a Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 2 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas13 酶長期保存，請使用 Cas13 Dilution Buf er，#32013），crRNA、
Target RNA 及 ssRNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target RNA（例如 LOD 實驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
*反式剪切體系中探針的用量和預(yù)期反應(yīng)到達(dá)平臺期的時間可參考各批號 Cas 酶 transU 的具體數(shù)值，詳見本公司提供的 COA檢測報告。
實時熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，37℃反應(yīng)，每 30 sec 采集一次熒光信號。
實驗結(jié)果
注意事項
1. Cas13a 的順式剪切(cis-cleavage): Cas13a 在 crRNA 的引導(dǎo)下，特異性地剪切 target RNA，且對 target RNA的 PFS 序列要求并不嚴(yán)格。
2. Cas13a 的反式剪切(trans-cleavage): 當(dāng) target RNA 存在時，Cas13a/crRNA 與 target RNA 形成三元復(fù)合物(Cas13a/crRNA/target RNA)，同時，Cas13a 被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)體系中任意序列的單鏈 RNA切碎。
3. 為防止 RNase 污染，請保持實驗區(qū)干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。
4. Cas13a 蛋白對熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
5. 本公司提供的 Cas13a 蛋白及反應(yīng)緩沖液不含任何除 Cas13a 外的任何其它核酸酶活性。
6. 本產(chǎn)品僅供科研使用。
