R5421釀酒酵母菌株為K+/鉀離子缺陷型菌株,在文獻中也稱為CY162MATa型多用于K+鉀離子轉運蛋白的鑒定試驗中,也可用于K+/鉀離子通道或鈉鉀離子泵的鑒定試驗。Transformation marker為:ura3leu2,該菌株可以在含有100mMKCl的培養基中正常生長。在含有5-10mM KCl的培養基中生長緩慢,當培養基中KCI濃度低于0.5mMR5421(CY162)細胞停止生長。
操作方法:
1.CarrierDNA在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態,步驟如下:CarrierDNA放
95℃水浴或金屬浴3min快速插入冰中靜置3min再次放95℃水浴或金屬浴3min快速插入冰中,靜置 3min 以上。
*備注:Carrier DNA加入請提前變性處理:95-100℃5min快速冰浴重復一次置于冰浴5min之內使用
2.取100u冰上融化的 R5421感受態細胞依次加入預冷的目的質粒0.5-3ugCarrier DNA 10ul PEG/LiAc 500ul并吸打幾次混勻30℃水浴 30min(15min時翻轉 6-8 次混勻)。
3.將管放42℃水浴15min(75min 時翻轉6-8次混勻)。
4.5000rpm離心40s棄上清ddH400ul重懸,離心30s棄上清。5ddH 50ul重懸,涂板、29℃培養 48-96h
注意事項:
1.感受態細胞zuihao在冰上融化。
2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。
3.同時轉化 2-3種質粒時可增加質粒的用量
4R5421酵母菌株對高溫敏感zuishi生長溫度為27-30℃高于31℃生長速度和轉化效率呈指數下降。