X-33是畢赤酵母菌株，屬于真核細(xì)胞。一般的針對(duì)原核生物的抗生素例如卡那和氨芐對(duì)酵母是無(wú)效的因此為了防止大腸桿菌等原核生物對(duì)酵母培養(yǎng)菌株污染往往會(huì)在培養(yǎng)基中加入一些氨芐和kanameisu的

抗生素,來(lái)抑制細(xì)菌菌的污染和生長(zhǎng)畢赤酵母話(huà)宜的生長(zhǎng)溫度是28至30℃溫度超過(guò)32C對(duì)蛋白的

表達(dá)是有害的，并可能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡

X-33畢赤酵母被推薦用來(lái)表達(dá)含有Zeocin抗性的載體載體重組質(zhì)粒，例如pPICZABC系列的載體。在篩選X-33重組轉(zhuǎn)化菌株時(shí)，Zeocin抗生素的工作濃度是100ug/ml

基因型為:野生型;表型:Mut+。

操作方法:

1.取0.1-5ug質(zhì)粒DNA(線(xiàn)性化質(zhì)粒加入量5-50μg)和10uL 預(yù)變性 Carrier DNA，加入到未融化的100-200uL感受態(tài)細(xì)胞上，置于30℃水浴每隔15S顛倒混勻，直至感受態(tài)細(xì)胞剛好wanquan融化(融化后及時(shí)取出)。

2.加入1.4 mL B2 溶液穎倒混勻。30℃水浴60min每隔20min顛倒混勻。

3.3000rpm離心3min棄上清留菌體沉淀，加入1mLB3溶液重懸菌體。

4.3000rpm離心3min 棄上清留菌體沉淀，加入100uL B3溶液重懸菌體。

5.將100uL菌液全部涂布到相應(yīng)的平板培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)3-5天，直至平板出現(xiàn)酵母克隆

注意事項(xiàng):

1.初次使用 Carrier DNA.請(qǐng)把裝有Carrier DNA的管子在沸水中煮沸5min，然后立即放在冰

上,用后放在-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｏ麓问褂们罢?qǐng)于冰上解凍Carrier DNA反復(fù)凍融3-5次后需重新變性 Carrier DNA

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3.同時(shí)轉(zhuǎn)化 2-3 種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量

4.畢赤酵母適宜的生長(zhǎng)溫度是28℃至30℃，溫度超過(guò)32℃對(duì)蛋白的表達(dá)是有害的，并可能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。