高轉化效率釀酒酵母VL6-48((ATCCno.MYA-3666)因TRP1基因缺失而不能在Trp缺陷培養基中生長。因此TRP1基因可用作一個選擇標記。對該菌株,HIS3基因也可作為選擇標記URA3基因作為標記。不推薦直接做克隆實驗,盡管該菌株是URA3基因缺陷(The URA3gene on its chromosome is inactivated but not deleted, and thus unwanted recombination occurs at relatively high frequency between chromosomal URA lociand the URA gene on the vector)
基因型為:MATalphahis3-D200trpl-Dura3-52lys2ade2-10met4psi+cir0
操作方法:
1.取100uL冰上融化的VL6-48感受態細胞,依次加入預冷的目的質粒2-5ugCarrier DNA(95100℃5min快速冰浴重復一次)10uLPEG/LiAc500uL 并吸打幾次混勻30℃水浴30min(15 min 時翻轉 6-8 次混勻 )。
0
2.將離心管放42℃水浴15min(7.5min 時翻轉 6-8 次混勻)。
3.5000rpm離心40s棄上清,ddH400uL重懸,離心30s棄上清。
4.ddHo50-100uL重懸涂板,29℃培養 48-96h
注意事項:
1.感受態細胞zuihao在冰上融化
2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌最
3.同時轉化 2-3 種質粒時可增加質粒的用量。
4.一般釀酒酵母菌株對高溫敏感,zuishi生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉化效率呈指數下降。
5.菌落變粉不是污染,是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后,平板上的 Adenine 被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用。然而,有些菌株的 ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE578基因均正常,所以造成中間產物 P-ribosvlamino imidazole(AIR)在細胞中積累而使菌落變為粉紅色
6.酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢,培養基中缺陷成分越多生長越慢,以轉化涂板為例:涂YPDA 平板 29℃48h培養可見直徑 1mm 克隆涂SD 單缺平板29℃.48-60h培養可見直徑1mm 克隆。