ER-Tracker探針是一系列具有細(xì)胞膜透過(guò)性，對(duì)活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有高度選擇性的探針，不像傳統(tǒng)的DiOC6(3)，該系列探針幾乎不對(duì)線粒體著色，且在較低濃度即可實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色，且對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性。使用以下提供的優(yōu)化步驟對(duì)活細(xì)胞染色后用醛固定，可以部分保留活細(xì)胞的染色特征。

使用方法

本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)化，且已被其他常規(guī)細(xì)胞系驗(yàn)證。但不同的細(xì)胞類(lèi)型其最佳使用條件不同，還需用戶根據(jù)該方案進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1. 試劑準(zhǔn)備

使用前將ER-Tracker Green (BODIPY® FL Glibenclamide)回溫至室溫，并簡(jiǎn)短離心使該DMSO溶液至管底。

2.  細(xì)胞樣品處理及染色

2.1 將1mM ER-Tracker Green (BODIPY® FL Glibenclamide)儲(chǔ)存液按照實(shí)驗(yàn)要求稀釋至工作濃度，推薦工作濃度為～1µM。建議在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下盡量使用較低濃度探針，以避免由于濃度過(guò)高染色導(dǎo)致的假象。

注：使用含Ca2+、Mg2+ Hank’s （HBSS/Ca/Mg）稀釋該探針進(jìn)行染色，可得到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 染色

對(duì)于貼壁細(xì)胞，吸除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用HBSS清洗細(xì)胞，加入預(yù)熱的染料工作液于37℃孵育細(xì)胞15-30min。吸除染色液，加入不含探針的新鮮培養(yǎng)液，并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

細(xì)胞如需固定，請(qǐng)參考以下步驟。

3．細(xì)胞固定

3.1 固定細(xì)胞：用4%甲醛于37℃固定細(xì)胞2min。

注：已染色細(xì)胞用醛固定后，僅部分ER-Tracker Green (BODIPY® FL Glibenclamide)留在細(xì)胞內(nèi)，熒光信號(hào)會(huì)有部分衰減。

3.2 清洗觀察細(xì)胞：細(xì)胞固定后，可用合適緩沖液進(jìn)行清洗，每次5min，共2次。清洗后可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)封片、鏡檢或進(jìn)一步染色。

注：不建議對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化處理，因?yàn)榻?jīng)Triton X-100透化后，無(wú)信號(hào)保留。