攝取脂肪酸是治療許多人類疾?。ɡ绶逝职Y，2型糖尿病和肝脂肪變性）的重要治療目標。Screen Quest™熒光脂肪酸攝取測定試劑盒為測量含有脂肪酸轉運蛋白的細胞中的脂肪酸攝取提供了一種簡單而靈敏的方法。該套件使用專有的十二酸熒光脂肪酸底物?？梢栽诰哂械撞孔x取模式或FITC通道的任何熒光酶標儀上進行此脂肪酸攝取測定試劑盒。該測定可以在96孔或384孔微量滴定板中以簡單的混合和讀取程序進行，并且很容易適用于高通量篩選應用。

平臺

組件

協議范例

乍看上去

協議摘要

1. 平板細胞在生長培養基中4-6小時

2. 將細胞轉移至無血清培養基中1小時，然后根據需要處理細胞

3. 添加100 µL /孔的脂肪酸上染溶液

4. 立即監測動力學在Ex / Em = 485/515 nm時的熒光增強，或在孵育60分鐘后監測終點讀數（底部讀數模式）

重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，制備后應儲存在-20°C下。避免重復凍融循環。

TF2-C12脂肪酸儲備溶液：
將20 µL DMSO（組分C）添加到TF2-C12脂肪酸（組分A）小瓶中，并充分混合。注意：20 µL的熒光脂肪酸底物儲備液足以裝一板。如果將試管緊密密封并避光，則可以將未使用的熒光脂肪酸底物原液分裝并在< -20 ^o C下保存兩個月。避免重復凍融循環。

準備工作溶液

加載脂肪酸染料的溶液：
將20 µL TF2-C12脂肪酸儲備溶液添加到10 mL的測定緩沖液（組分B）中，并充分混合。注意：  10毫升脂肪酸染料上樣溶液足以裝滿一盤；為每個盤子準備新鮮的食物并進行實驗。

程序

細胞制備：

根據需要準備細胞。以下方案是制備3T3-L1脂肪細胞的指南。

• 準備分化的3T3-L1脂肪細胞（參見參考文獻1）：3T3-L1成纖維細胞在DMEM / FBS匯合后在75 cm燒瓶中培養2天，然后在補充有0.83 µM胰島素，0.25 µM的DMEM / FBS中培養2天。disaimisong和0.25 mM異丁基甲基huangpiaoling。更換培養基以維持disaimisong和IBMX不在另外2天的胰島素濃度。然后將培養基更換為單獨的DMEM / FBS，持續3-5天。在分化誘導后的第8至12天使用分化的細胞（其中至少95％通過脂質液滴的積累顯示出脂肪細胞表型）。
  

• 在生長培養基中以50,000-80,000個細胞/孔/ 100 µL / 96孔或12,500-20,000個細胞/孔/ 25 µL / 384孔黑墻/透明底部細胞培養板接種3T3-L1脂肪細胞，用Poly-D賴氨酸板固定4個實驗前-6小時。斷開制動器，以800 rpm的速度離心板2分鐘。 注意：建議將3個僅含生長培養基的孔（無細胞）平板作為空白孔進行數據歸一化。 注意：我們發現在同一天（4-6小時，然后血清被剝奪1小時）接種的脂肪細胞比接種過夜的脂肪細胞效果更好。

• 從培養箱中取出細胞板，從孔中吸出培養基，并用90 µL /孔/ 96孔板或20 µL /孔/ 384孔板的無血清培養基剝奪細胞。將細胞在37oC，5％CO ₂培養箱中孵育1小時。
  

• 通過添加10 µL /孔/ 96孔板（5 µL /孔/ 384孔板）或1X Hanks和20 mM Hepes緩沖液（1X HBSS，pH 7.4）或您選擇的緩沖液來處理細胞復合稀釋劑。對于空白孔，添加化合物稀釋劑。將細胞在37℃，5％CO ₂培養箱中孵育所需的時間（對于用胰島素處理的3T3-L1細胞，則需要30分鐘）。

樣本協議：

1. 根據需要用測試化合物處理細胞。
   

2. 從培養箱中取出經過化合物處理的細胞板，添加100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）（包括空白孔）的脂肪酸染料上載溶液。
   

3. 使用底部讀取模式，使用熒光酶標儀在Ex / Em = 485/515 nm（在495 nm處截止）下測量熒光信號。注意：對于動態讀數：以20秒的間隔立即讀取熒光強度，持續30-60分鐘。注意：對于終點讀數：在30-60分鐘孵育結束時讀取熒光強度。