基質金屬蛋白酶（MMP）構成了一族依賴鋅的內肽酶，在細胞外基質中發揮作用。這些酶負責結締組織的分解，在骨骼重塑，月經周期和組織損傷修復中很重要。雖然很難評估MMP對某些病理過程的確切貢獻，但MMP似乎在關節炎的發展以及癌癥的侵襲和轉移中起著關鍵作用。MMP傾向于具有多種底物，大多數家族成員具有降解不同類型膠原蛋白以及彈性蛋白，明膠和纖連蛋白的能力。很難找到對單個MMP酶具有選擇性的底物。該FRET底物經設計對MMP-3具有較高的選擇性。它用于監視MMP-3活動。當使用純化的MMP-3酶時，它也可用于篩選MMP-3抑制劑。該FRET基板基于我們的TF2 / TQ2 FRET對。在MMP-3水解后，由于TF2 / TQ2 FRET對已分離，因此MMP-3 Green™FRET肽底物的熒光增強。熒光增加與MMP-3酶活性成正比。

平臺

組件

協議范例

乍看上去

協議摘要

1. 添加適當的對照或測試樣品（50 µL）
2. 預孵育10-15分鐘
3. 添加MMP-3 Green™底物工作溶液（50 µL）
4. 跳過孵育以獲取動力學讀數，或孵育30至60分鐘以獲取終點讀數
5. 監測Ex / Em = 490/525 nm的熒光強度

重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。根據需要準備包含MMP-3的生物樣品。

準備工作溶液

1. MMP-3 Green™底物工作溶液：
將50μLMMP-3 Green™底物（組分A）添加到5 mL的測定緩沖液（組分C）中，使總體積為5.05 mL。

2. MMP-3稀釋：
如果使用純化的MMP-3，則在測定緩沖液（組分C）中將MMP-3稀釋至適當濃度。注意：  MMP-3需要在使用前激活。避免酶劇烈渦旋。

3.抑制劑和化合物的稀釋：
如果要篩選MMP-3抑制劑，請根據需要適當調配已知濃度的MMP-3抑制劑和測試化合物稀釋液。

程序

表1.在96孔微孔板中適當的對照（根據需要）和測試樣品的布局。SC =底物對照，IC =抑制劑對照，VC =載體對照，TC =測試化合物對照，TS =測試樣品。

表2.每個孔的試劑組成。注意：某些強熒光測試化合物可能會導致假陽性結果。

1. 根據需要準備包含MMP-3的生物樣品。

2. 要激活pro-MMP-3，請先用1：500的測定緩沖液（組分C）稀釋1M APMA（組分B），以獲得2 mM APMA工作溶液（2X）。注意： APMA屬于有機汞。小心輕放！請按照當地法規進行處理。
   
   接下來，將含有MMP-3的樣品或純化的MMP-3與等體積的2 mM APMA工作溶液（2X）在37°C下孵育24小時。在實驗之前立即激活MMP-3。注意：將含酶的樣品放在冰上。避免劇烈渦旋酶。活化酶的長時間儲存??將使酶失活。為了酶的活化，優選以較高的蛋白質濃度活化。激活后，您可以進一步稀釋該酶。

3. 根據表1和2中提供的布局準備對照和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用20 µL試劑代替50 µL。

4. 如果要篩選MMP-3抑制劑，請在所需的酶反應溫度（例如25°C或37°C）下將板預孵育10-15分鐘。
    
5. 將50 µL（96孔）或20 µL（384孔）的MMP-3 Green™底物工作溶液添加到樣品和測定板的對照孔中。充分混合試劑。
    
6. 使用熒光板讀數器在Ex / Em = 490/525 nm處監控熒光強度。
   
   對于動力學讀數：立即開始測量熒光強度，并每5分鐘連續記錄數據30至60分鐘。
   
   對于終點讀數：將反應在室溫下孵育30至60分鐘，如果可能，請避開光線。充分混合試劑，然后測量熒光強度。