酮體是由肝臟產(chǎn)生的，當血糖水平下降時，其外圍可用作能量來源。兩個主要的酮體是β-羥基丁酸酯（Beta-HB）和乙酰乙酸酯，而丙酮是第三大酮體。通常，在禁食和長時間運動期間，這兩個主要的酮體在血液中的含量很少。在患有糖尿病，酒精或水楊酸鹽中毒，激素缺乏癥，兒童低血糖癥和其他急性疾病的患者中，血液中會發(fā)現(xiàn)大量的酮體。血液中酮體的過度產(chǎn)生和積累（酮癥）可導致病理性代謝性酸中毒（酮癥酸中毒）。在情況下，酮癥酸中毒可能是致命的。可以量化β-HB的血酮測試方法 血液中的主要酮體（約75％）已用于診斷和監(jiān)測酮酸中毒的治療。Amplite™熒光β-羥基丁酸熒光測定試劑盒提供了靈敏的熒光測定法，用于測量生物樣品中的β-HB水平。該測定基于β-HB的酶偶聯(lián)反應，其中產(chǎn)物NADH可通過熒光NADH傳感器進行特異性監(jiān)測。熒光信號可以通過熒光酶標儀讀取。使用這種熒光β-羥基丁酸熒光測定試劑盒，我們能夠在100 µL反應體積中檢測到低至1.4 µM Beta-HB。該測定基于β-HB的酶偶聯(lián)反應，其中產(chǎn)物NADH可通過熒光NADH傳感器進行特異性監(jiān)測。熒光信號可以通過熒光酶標儀讀取。使用這種熒光β-羥基丁酸熒光測定試劑盒，我們能夠在100 µL反應體積中檢測到低至1.4 µM Beta-HB。該測定基于β-HB的酶偶聯(lián)反應，其中產(chǎn)物NADH可通過熒光NADH傳感器進行特異性監(jiān)測。熒光信號可以通過熒光酶標儀讀取。使用這種熒光β-羥基丁酸熒光測定試劑盒，我們能夠在100 µL反應體積中檢測到低至1.4 µM Beta-HB。

1. 準備β-HB標準品或測試樣品（50 µL）
2. 加入β-HB工作溶液（50 µL）
3. 在室溫下孵育10-30分鐘
4. 監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm時的熒光增加

重要說明
為了獲得*效果，強烈建議使用黑色印版。開始實驗前，在室溫下解凍每個試劑盒成分的小瓶。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復凍融循環(huán)。

1. NAD儲備溶液（100X）：
將100 µL H ₂ O加入NAD小瓶（組分C）中，制成100X NAD儲備溶液。

2.β-HB標準溶液（100 mM）：
將1 mL H ₂ O或1X PBS緩沖液加到β-HB標準瓶（組分D）中，制成100 mMβ-HB標準溶液。

配制標準溶液

為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計

將10 µL的β-HB標準溶液（100 mM）加入990 µL 1x PBS緩沖液中，以生成1000 µM的β-HB標準溶液（HB7）。取1000 µMβ-HB標準溶液，并在1x PBS中進行1：3連續(xù)稀釋，以獲得β-HB標準（HB6-HB1）的連續(xù)稀釋液。注意：稀釋的β-HB標準溶液不穩(wěn)定，應在4小時內(nèi)使用。

準備工作溶液

1.將5 mL測定緩沖液（組分B）加入一瓶酶混合物（組分A）中。

2.將50 µL NAD儲備溶液添加到組分A + B的瓶子中，并充分混合以制成β-HB工作溶液（組分A + B + C）。注意：此β-HB工作溶液不穩(wěn)定，請立即使用，并避免直接暴露在光線下。

程序

表1.在透明的底部96孔微孔板中的β-HB標準品和測試樣品的布局。HB =β-HB標準品（HB1-HB7，1至1000 µM）；BL =空白對照；TS =測試樣品。

表2.每個孔的試劑組成。

1. 根據(jù)表1和表2提供的布局，將β-HB標準品（HB），空白對照（BL）和測試樣品（TS）制成黑色96孔微孔板。對于384孔板，請使用25 µL每孔試劑，而不是50 µL。
    
2. 將50 µLβ-HB工作溶液添加到β-HB標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中，以使總體積為100 µL /孔。對于384孔板，將25 µLβ-HB工作溶液添加到每個孔中，總體積為50 µL /孔。
    
3. 在避光條件下，于室溫下孵育反應10-30分鐘。
    
4. 使用熒光板讀數(shù)器在激發(fā)= 530-570 nm，發(fā)射= 590-600 nm（*Ex / Em = 540/590 nm，在570 nm截止）下監(jiān)測熒光的增加。

數(shù)據(jù)分析

1e+4100010010010- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™β-Hydroxybutyrate (uM)RFUHover mouse to interact

從空白標準孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對照。從其他標準的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標準讀數(shù)，以獲得標準曲線和方程式。該方程可用于計算β-羥基丁酸酯樣品。