5
大腸桿菌β-半乳糖苷酶是464 kD四聚體。β-半乳糖苷酶的每個單元均包含五個域，其中第三個域是活性位點。它是細胞中*的酶。該酶缺乏會導致半乳糖唾液酸中毒或Morquio B綜合征。在大腸桿菌中，β-半乳糖苷酶是通過激活LacZ操縱子產生的。檢測LacZ表達已成為常規的檢測點，每個細胞僅檢測5個拷貝的β-半乳糖苷酶。該試劑盒使用了一種熒光半乳糖苷酶底物，可以靈敏地區分LacZ +與LacZ細胞。它可用于在ELISA類型測定系統中檢測半乳糖苷酶偶聯物，或用于監測細胞中LacZ基因的表達。
| 熒光酶標儀 | |
| 激發 | 490納米 |
| 發射 | 525納米 |
| 隔斷 | 515納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
組件
| 成分A：熒光素二-β-D-吡喃半乳糖苷（FDG） | 1個小瓶 |
| 組分B：反應緩沖液 | 1瓶（50毫升） |
| 組件C：停止緩沖區 | 1小瓶（25毫升） |
| 組分D：裂解緩沖液 | 1小瓶（25毫升） |
| 成分E：DMSO | 1小瓶（500 µL） |
| 成分F：β-巰基乙醇 | 1小瓶（500 µL） |
- 用LacZ基因制備穩定或瞬時轉染的細胞
- 用測試化合物孵育細胞（樣品）
- 裂解細胞
- 將裂解液轉移到微量滴定板
- 添加FDG工作解決方案
- 根據細胞類型，在室溫或37°C孵育至少5分鐘
- 添加停止解決方案
- 監測Ex / Em = 490/525 nm的熒光強度
重要說明
使用前，將所有套件組件解凍至室溫。
儲備溶液的制備
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復凍融循環。
1. FDG儲備溶液（1X）：
將125 µL DMSO（組分E）添加到FDG（組分A）小瓶中，制成1X FDG儲備溶液。注意：25 µL FDG足以裝滿1個板。遠離光線。
配制標準溶液
為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計
可選（如果需要標準曲線）：用0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液制備一系列β-半乳糖苷酶（大腸桿菌）標準品的稀釋液。將標準曲線上每個點的等分試樣50 µL轉移至平板的對照孔中。推薦的zui高β-半乳糖苷酶含量為200 mU / mL（200-400 ng）。建議對標準曲線進行2倍系列稀釋，包括8個點。注意：調整標準曲線以適合特定的實驗條件，例如細胞類型，數量，轉染效率和培養板大小。每次進行測定時，必須新鮮制備標準曲線的稀釋液。
準備工作溶液
1. 0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液：
將30 µLβ-巰基乙醇（組分F）添加到10 mL反應緩沖液（組分B）中，并充分混合。
注意：制備酶稀釋緩沖液需要額外的緩沖液，用于生成標準曲線。
2. FDG工作溶液：
將25 µL 1X FDG儲備溶液加入5 mL的0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液中。 注意：請勿將FDG溶液在室溫下長時間放置，否則會發生自發水解。
3.裂解緩沖液工作溶液：使用前，
將5 µLβ-巰基乙醇（組分F）加入5 mL裂解緩沖液（組分D）中。注意：裂解細胞前，始終將0.1％β-巰基乙醇添加到裂解緩沖液中
程序
表1.細胞培養板推薦的Lysis Buffer工作溶液體積。
| 培養板類型 | 裂解緩沖液工作溶液（µL /孔） |
| 96孔板 | 50 |
| 24孔板 | 250 |
| 12孔板 | 500 |
| 6孔板 | 1000 |
| 60毫米板 | 2000 |
| 100毫米板 | 4000 |
從哺乳動物細胞制備細胞提取物
- 用測試化合物處理含有LacZ基因的細胞所需的時間。
- 用1X PBS洗滌細胞兩次。不要移動細胞。
- 用Lysis Buffer工作溶液相應地裂解細胞。
對于貼壁細胞：將Lysis Buffer工作溶液添加至培養板。有關建議的數量，請參見表1。
對于非貼壁細胞：將細胞沉淀到離心管中，并向管中加入50-2000 µL Lysis Buffer工作溶液（取決于細胞沉淀的大小）。
- 將上一步的細胞在室溫下孵育10-15分鐘，然后輕輕旋轉平板或試管數次以確保*裂解。
- 繼續進行FDG測定或將樣品在-80°C下冷凍直至使用。注意：通過快速的凍融循環（在-20°C到-80°C冷凍1-2小時，然后在室溫解凍）也可以獲得良好的裂解。或者，將細胞裂解液離心2-3分鐘以沉淀不溶物，然后測定上清液。
運行ß-半乳糖苷酶測定
- 如果需要，在室溫下解凍裂解細胞管或板。如果細胞接種在96孔板中，則直接在96孔板上進行測定。
- 在96孔板的每個孔中加入50 µL細胞提取物。如果需要標準曲線，請為標準曲線保留一些對照孔（50 µL /孔）。注意： 如有必要，當轉染效率很高時，可在裂解緩沖液工作溶液中稀釋裂解液，或在轉染效率低時減少裂解液的體積。如果在96孔板上進行轉染，或將穩定的細胞系接種到96孔板上，請直接在板上進行測定。對于內源性β-半乳糖苷酶活性控制，請添加50 µL來自未轉染細胞的細胞裂解液。對于空白對照，添加50 µL 1X裂解緩沖液。
- 向每個孔中加入50 µL FDG工作溶液。根據細胞類型，將板在室溫或37°C下孵育大約5分鐘至4小時。
- 向每個孔中添加50 µL終止緩沖液（組分C）。終止緩沖液除了終止反應外，還引起產物的熒光強度增加。
- 用熒光酶標儀在Ex / Em = 490/525 nm處測量每個孔中溶液的熒光強度。
- 根據線性標準曲線定量ß-半乳糖苷酶表達。
12601 Amplite™熒光法β-半乳糖苷酶檢測試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ Fluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit *Green Fluorescence* 1 kit 12602 Amplite™熒光法神經氨酸酶檢測試劑盒 *藍色熒光* Amplite™ Fluorimetric Neuraminidase Assay Kit *Blue Fluorescence* 1 kit 12603 Amplite™熒光法β-半乳糖苷酶檢測試劑盒 *紅色熒光* Amplite™ Fluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit *Red Fluorescence* 1 kit 12604 Amplite™比色法β-半乳糖苷酶檢測試劑盒 Amplite™ Colorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit 1 kit 12609 NTA 馬來酰亞胺 NTA maleimide 5 mg
