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過氧化氫（H2O2）是一種活性氧代謝副產(chǎn)物，可作為許多氧化應(yīng)激相關(guān)狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。它涉及許多與哮喘，動脈粥樣硬化，糖尿病性血管病變，骨質(zhì)疏松癥，許多神經(jīng)退行性疾病和唐氏綜合癥有關(guān)的生物學(xué)事件。過氧化氫生物學(xué)有趣的方面也許是zui近的報道，即抗體具有將分子氧轉(zhuǎn)化為過氧化氫的能力，有助于免疫系統(tǒng)的正常識別和破壞過程。對這種反應(yīng)性物種的測量將有助于確定氧化應(yīng)激如何調(diào)節(jié)各種細(xì)胞內(nèi)途徑。該Cell Meter™過氧化氫檢測試劑盒使用我們*的OxiVision™Green過氧化氫傳感器對活細(xì)胞中的過氧化氫進(jìn)行定量。OxiVision™Green具有細(xì)胞滲透性，當(dāng)它與過氧化氫反應(yīng)時會發(fā)出綠色熒光。該套件是一種優(yōu)化的“混合與讀取”化驗(yàn)格式，與HTS液體處理儀器兼容。
| 熒光顯微鏡 | |
| 激發(fā) | FITC頻道 |
| 發(fā)射 | FITC頻道 |
| 推薦板 | 黑墻/透明底 |
| 熒光酶標(biāo)儀 | |
| 激發(fā) | 490納米 |
| 發(fā)射 | 525納米 |
| 隔斷 | 515納米 |
| 推薦板 | 黑墻/透明底 |
| 儀器規(guī)格 | 底讀模式 |
| 組件A：OxiVision Green™過氧化氫傳感器 | 1個小瓶 |
| 成分B：H2O2 | 1小瓶（3％穩(wěn)定溶液，200 µL） |
| 組分C：測定緩沖液 | 1瓶（20毫升） |
| 成分D：DMSO | 1小瓶（200 µL） |
- 準(zhǔn)備并添加Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液（50 µL）
- 加入H 2 O 2標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50 µL）
- 在室溫下孵育15-60分鐘
- 在Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）時讀取熒光強(qiáng)度
重要說明
開始實(shí)驗(yàn)之前，請?jiān)谑覝叵陆鈨鏊性噭┖薪M件。
活細(xì)胞分析的方案摘要
- 在生長培養(yǎng)基中準(zhǔn)備細(xì)胞
- 用Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液對細(xì)胞染色，并孵育所需的時間
- 用測試化合物處理細(xì)胞
- 使用底部讀取模式監(jiān)控Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）的熒光強(qiáng)度
重要說明
Amplite™綠色過氧化物傳感器可以被動加載到活細(xì)胞中，并報告細(xì)胞內(nèi)H 2 O 2濃度的微摩爾變化。以下是建議的顯微鏡成像協(xié)議，可以對其進(jìn)行修改以滿足特定的研究需求。
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1. Amplite™綠色過氧化物傳感器原液（250X）：
將50 µL DMSO（組分D）添加到Amplite™綠色過氧化物傳感器（組分A）的小瓶中，制成250X Amplite™綠色過氧化物傳感器原液。避光。
2. H 2 O 2標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 mM）：
將22.7 µL的3％H 2 O 2（0.88 M，組分B）添加到977 µL的測定緩沖液（組分C）中，制成20 mM H 2 O 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液。注意：稀釋的H 2 O 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定。未使用的部分應(yīng)丟棄。
配制標(biāo)準(zhǔn)溶液
為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計(jì)
向950 µL的測定緩沖液（組分C）中加入50 µL的20 mM H 2 O 2標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到1000 µM H 2 O 2的 標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1000 µM H 2 O 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，以使用測定緩沖液（組分C）獲得連續(xù)稀釋的H 2 O 2標(biāo)準(zhǔn)溶液（HS1- HS7）。
準(zhǔn)備工作溶液
將20μL250X Amplite™綠色過氧化物傳感器原液添加到5 mL的測定緩沖液（組分C）中，制成Amplite™綠色過氧化物傳感器工作液。
程序
在上清液反應(yīng)中運(yùn)行H 2 O 2分析：
表1.黑色96孔微孔板 中H 2 O 2標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局。HS = H 2 O 2標(biāo)準(zhǔn)品（HS1-HS7，300至0.3 µM）；BL =空白控件；TS =測試樣品
| BL | BL | TS | TS |
| HS1 | HS1 | ... | ... |
| HS2 | HS2 | ... | ... |
| HS3 | HS3 | ||
| HS4 | HS4 | ||
| HS5 | HS5 | ||
| HS6 | HS6 | ||
| HS7 | HS7 |
表2. 每個孔的試劑組成。
| 好 | 體積 | 試劑 |
| HS1-HS7 | 50微升 | 連續(xù)稀釋液（300至0.3 µM） |
| BL | 50微升 | 分析緩沖液（組分C） |
| TS | 50微升 | 測試樣本 |
- 根據(jù)表1和表2提供的布局，準(zhǔn)備H 2 O 2標(biāo)準(zhǔn)品（HS），空白對照（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50微升。
- 向H 2 O 2標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中添加50 µL Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液，以使總H 2 O 2分析體積為100 µL /孔。對于384孔板，向每個孔中添加25 µL Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液，總體積為50 µL /孔。
- 在避光條件下，于室溫下孵育反應(yīng)15至30分鐘。
- 使用熒光板讀數(shù)器在激發(fā)= 490±10，發(fā)射= 520±10 nm（*Ex / Em = 490/525 nm，截止= 515 nm）下監(jiān)控?zé)晒庠黾印?/li>
在活細(xì)胞中進(jìn)行H 2 O 2分析：
- 根據(jù)需要激活單元格。
- 用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞與100 µL /孔的Amplite™Green Peroxide Sensor工作溶液孵育5至60分鐘或所需的時間。對于384孔板，請?zhí)砑?5 µL /孔的Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液。注意：為了進(jìn)行動力學(xué)測量，可以在添加處理之前對細(xì)胞進(jìn)行染色。
- 使用熒光板讀數(shù)器（底部讀取模式）在Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）下監(jiān)視熒光的增加，或使用FITC通道使用熒光顯微鏡對熒光變化進(jìn)行成像。
11500 Amplite™ 比色法過氧化氫檢測試劑盒 Amplite™ Colorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit 500 Tests 11501 Amplite™熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *紅色熒光* Amplite™ Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Red Fluorescence* 500 Tests 11502 Amplite™熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *近紅外熒光* Amplite™ Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Near Infrared Fluorescence* 500 Tests 11503 Amplite™熒光法胞內(nèi)辣根過氧化物酶檢測試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ Intracellular Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Green Fluorescence* 200 Tests 11504 Cell Meter™細(xì)胞內(nèi)熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *藍(lán)色熒光* Cell Meter™ Intracellular Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Blue Fluorescence* 100 Tests 11505 Cell Meter™細(xì)胞內(nèi)熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *藍(lán)色熒光適用于流式細(xì)胞儀* Cell Meter™ Intracellular Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Blue Fluorescence Optimized for Flow Cytometry* 100 Tests 11506 Cell Meter™細(xì)胞內(nèi)熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *綠色熒光適用于流式細(xì)胞儀* Cell Meter™ Intracellular Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Green Fluorescence Optimized for Flow Cytometry* 100 Tests
