DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）使用說明書

（貨號：WLB8201KIT）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短（僅需30 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。

金屬浴、水浴鍋等即可進(jìn)行反應(yīng)操作，無需購買PCR擴(kuò)增儀等價(jià)格高昂的專屬設(shè)備。

引物設(shè)計(jì)：

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度；引物設(shè)計(jì)避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

試劑盒組成：

試劑盒儲(chǔ)存：

運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸；

儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 ºC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；

產(chǎn)品有效期：12個(gè)月。

操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1)    每個(gè)干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需*融化混勻，否則會(huì)對實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；

2)    每個(gè)反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物和2 μL下游引物（引物濃度10 μM，對于多個(gè)反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

3)    向反應(yīng)管中依次加入12.1 μL ddH₂O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH₂O體積，至模板與ddH₂O總體積為14.1 μL）;

4)    zui后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（對于多個(gè)反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，上下顛倒反應(yīng)管8-10次混勻）；

5)    混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中37-39 ºC孵育30 mins；

6)    反應(yīng)結(jié)束后，加入50 μLfen/lv仿，1:1抽提反應(yīng)液，12000 rpm離心5 mins，取5 μL上清進(jìn)行電泳檢測。（或者使用DNA產(chǎn)物純化試劑盒處理反應(yīng)液后進(jìn)行電泳檢測）

體系配制

*正對照反應(yīng)單元體系配制：正對照模板加入2μL，引物加入4 μL正對照引物Mix（包含上/下游引物），其他組分參照體系配制。

注意事項(xiàng)：

1．  由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請注意避免微量待擴(kuò)增核酸污染，并盡量考慮設(shè)置空白對照以確認(rèn)是否有核酸污染。

2．  試劑盒保質(zhì)期12個(gè)月。每次使用時(shí)，請取出實(shí)驗(yàn)所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，置于冰浴條件下并在8小時(shí)內(nèi)使用；剩余部分，請置于存儲(chǔ)條件下。