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上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
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檢測(cè)細(xì)胞衰老方法
2023-4-23 閱讀(96)
細(xì)胞衰老是細(xì)胞在正常環(huán)境條件下發(fā)生的功能減退、逐漸趨向死亡的現(xiàn)象。衰老的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大，呈扁平狀；細(xì)胞核變大，核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)聚集、固縮、裂解；胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加，有空泡形成；線粒體的數(shù)目及形狀發(fā)生改變；膜流動(dòng)性降低；溶酶體內(nèi)容物增多，導(dǎo)致溶酶體酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老細(xì)胞所具有的上述特征成為各種細(xì)胞衰老檢測(cè)手段的依據(jù)。
細(xì)胞衰老檢測(cè)方法與步驟:
（1）細(xì)胞接種前在6孔培養(yǎng)板中預(yù)先放置滅菌的細(xì)胞片，每孔加入1×10E5個(gè)細(xì)胞，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞在細(xì)胞片上生長(zhǎng)。
（2）在超凈工作臺(tái)中吸棄6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入×1 PBS，洗滌細(xì)胞1次，隨后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，室溫條件下固定3~5分鐘。
（3）吸棄2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，加入×1 PBS，洗滌細(xì)胞3次，每次3分鐘。
（4）吸棄×1 PBS，加X(jué)-Gal溶液以浸沒(méi)細(xì)胞片為宜，37℃孵育4~8小時(shí)或過(guò)夜，用保鮮膜包被6孔培養(yǎng)板以防染液蒸發(fā)。
（5）取出細(xì)胞爬片，去離子水沖洗2次，再次用固定液固定4分鐘，流水輕輕沖洗。
（6）將細(xì)胞爬片按此順序脫水、透明∶95%酒精I(xiàn)（2分鐘）→95%酒精Ⅱ（2分鐘）→100%酒精I(xiàn)（2分鐘）→100%酒精I(xiàn)（5分鐘）→二甲苯I（2分鐘）→二甲苯Ⅱ（2分鐘）。
（7）中性樹(shù)膠封片。
（8）在普通光學(xué)顯微鏡下觀察衰老細(xì)胞形態(tài)。
每張片子鏡下計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，確定X-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞（衰老細(xì)胞）在細(xì)胞群體中的所占的百分比即衰老細(xì)胞率（藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/總計(jì)細(xì)胞數(shù)×100%）。
注意事項(xiàng):
（1）X-Gal溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。
（2）細(xì)胞固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或固定之后清洗不干凈，均會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)。
