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詳解PCR引物設計原則
2022-7-5 閱讀(2387)
PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
PCR 引物設計基本原則：
1）、引物長度：18-26bp，可放寬至18-30bp（有研究表明超過30bp再增加引物長度意義不大）；
2）、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3）、引物Tm：54-58℃，可放寬至52～62℃，GC%>60%可進一步放寬；
4）、擴增子Tm：>92℃；
5）、3'端：優選三聯體WSS、SWS、TTS，二連體GC，單體S，盡量規避WWW、CGW、GGG、CG；
6)、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有*互補序列，否則易導致非特異性擴增；
7）、末端2bp最好為GC；
8）、引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物su、熒光物質、de高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等；
9）、其他：避免3'端8bp及以上序列與模板多位點互補，盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補，盡量避免內部回文。
基于上述原則，實踐中兩種應用情況：
1、基因克隆PCR引物設計
這種情況我們往往并沒有太多選擇，只能從ATG開始，從TAA等結束，什么GC%、二聚體和錯配，可能根本由不得我們。既然起點定了，那只能通過改變長度來匹配*優設計要求了。
2、鑒定PCR引物設計
我們只需要確認一段DNA序列上的一部分，起點是相對的，我們可以在整個序列范圍內搜索，引物設計的靈活性大大提高，當然搜索時間也要增加。
