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上海澤葉生物科技有限公司
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更新時間:2016-11-28 14:59:13瀏覽次數(shù):367次
聯(lián)系我時,請告知來自 環(huán)保在線MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14)的處理方法:
1. 先從外包裝盒拿出離心管,在離心管表面噴一層酒精,并小心去掉封口膜;
2. 將離心管中的細胞在超凈工作臺內(nèi)取出一部分進行細胞計數(shù)(詳見細胞凍存)。
3. 如細胞密度小于3×106/ml,可直接將離心管中的細胞轉(zhuǎn)移到T25瓶中,置于37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
細胞名稱:MC3T3-E1 Subclone 14 小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14
組織來源:顱頂骨
培養(yǎng)條件:MEMα +10% FBS
形 態(tài):貼壁;成纖維細胞樣
背 景:從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1細胞系中分離出一系列亞克隆。從含抗壞血酸培養(yǎng)基生長的成骨細胞中選擇高或低成骨細胞分化、礦化的亞克隆。MC3T3亞克隆4(ATCC CRL-2593)和MC3T3亞克隆14(ATCC CRL-2594)在抗壞血酸和3到4mM無機磷酸鹽中生長表現(xiàn)出高水平的成骨細胞分化。它們10天后形成一個礦化良好的細胞外基質(zhì)(ECM)。MC3T3亞克隆24(ATCC CRL-2594)和MC3T3亞克隆30(ATCC CRL-2596)在抗壞血酸中生長表現(xiàn)出很差的成骨細胞分化。不形成ECM, 可以作為亞克隆4和14的陰性對照。礦化的亞克隆選擇的表達作為成骨細胞標(biāo)記的mRNA,及唾液酸糖蛋白(BSP),骨鈣素(OCN),和甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白受體的mRNA。高或者低的分化潛能的亞克隆在培養(yǎng)中生產(chǎn)出相似數(shù)量的膠原質(zhì),表達可比較的基本水平的mRNA編碼Osf2/Cbfa1,一種成骨細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。植入免疫缺陷小鼠以后,高分化性的亞克隆形成與骨類似的形成小骨的編織骨,低分化細胞只是產(chǎn)生纖維組織。這些細胞系是研究體外成骨細胞分化的好模型,尤其是ECM信號。它們和原代培養(yǎng)顱頂成骨細胞的行為類似。
MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14)“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間,與細胞世代或倍增不同。在一代中,細胞培增3~6次。細胞傳代后,一般經(jīng)過三個階段:游離期、指數(shù)增生期和停止期。常用細胞分裂指數(shù)表示細胞增殖的旺盛程度,即細胞群的分裂相數(shù)/100個細胞。一般細胞分裂指數(shù)介于0.2%~0.5%,腫瘤細胞可達3~5%。接種2~3天分裂增殖旺盛,是活力時期,稱指數(shù)增生期(對數(shù)生長期),適宜進行各種試驗。
formazan結(jié)晶的生成量僅與活MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14)數(shù)目成正比(死細胞中琥珀酸脫氫酶消失,不能將MTT還原)。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶標(biāo)儀測定490 nm處的光密度OD值,以反映出活細胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。MTT粉末和溶液保存時都需要避光,用鋁箔紙包好就可以。實驗的時候一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光,覺得這樣比較好。
1.接種:用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液,以每孔1000-10000個接種到96孔板,每孔體積200ul.
2.MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14)培養(yǎng):同一般培養(yǎng)條件,培養(yǎng)3-5天(可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間)。
3.呈色:培養(yǎng)3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.
繼續(xù)孵育4小時,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,對于懸浮需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO,振蕩10分鐘,使結(jié)晶物充分融解。
4.比色:選擇490nm波長,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值,記錄結(jié)果,以時間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14)生長曲線。
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