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上海永葉生物科技有限公司

CaCl2感受態(tài)細胞的制備的實驗步驟

時間:2011-11-7閱讀:662
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·CaCl2感受態(tài)細胞的制備的實驗步驟

  1.前夜接種受體菌(DH5α或DH10B),挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜(約16小時);

  2.取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mlLB培養(yǎng)基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(250-300rpm);

  3.將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷;

  以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作

  4.吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘;

  5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;

  6.棄去上清,加入100μl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮,在冰放置20分鐘;

  7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;

  8.棄去上清,加入100μl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;

  9.細胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護劑(15%-20%甘油)后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃)。

  ·電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗步驟

  1.前夜接種受體菌(DH5α或DH10B),挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜;

  2.取2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200mlLB培養(yǎng)基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6(約2.5-3小時);

  3.將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作

  4.吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘;

  5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;

  6.棄去上清,加入1500μl冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;

  7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘

  8.棄去上清,加入750μl冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;

  9.4℃下3000g冷凍離心5分鐘

  10.加入20μl冰冷10%的甘油,用移液器輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;

  11.立即使用或迅速置于-70℃超低溫保存。

  附注:

  影響感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實際操作過程中應(yīng)注意的事項:

  1.細菌的生長狀態(tài):實驗中應(yīng)密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度,盡量使用對數(shù)生長期的細胞(一般通過檢測OD600來控制。DH5α菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml);

  2.所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進行;

  3.經(jīng)CaCl2處理的細胞,在低溫條件下,一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加,24小時達到zui高,之后轉(zhuǎn)化率再下降(這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的);

  4.化合物及無機離子的影響:在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高(100-1000倍);

  5.所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細菌的轉(zhuǎn)化效率;

  6.質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響:用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA;

  7.一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比;

 

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