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·CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備的實(shí)驗(yàn)步驟
1.前夜接種受體菌(DH5α或DH10B),挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜(約16小時(shí));
2.取1ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mlLB培養(yǎng)基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(shí)(250-300rpm);
3.將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷;
以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作
4.吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘;
5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;
6.棄去上清,加入100μl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸浮,在冰放置20分鐘;
7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;
8.棄去上清,加入100μl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸浮;
9.細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑(15%-20%甘油)后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃)。
·電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟
1.前夜接種受體菌(DH5α或DH10B),挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜;
2.取2ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200mlLB培養(yǎng)基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6(約2.5-3小時(shí));
3.將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺(tái)和冰上操作
4.吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘;
5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;
6.棄去上清,加入1500μl冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸浮;
7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘
8.棄去上清,加入750μl冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸浮;
9.4℃下3000g冷凍離心5分鐘
10.加入20μl冰冷10%的甘油,用移液器輕輕上下吸動(dòng)打勻,使細(xì)胞重新懸浮;
11.立即使用或迅速置于-70℃超低溫保存。
附注:
影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng):
1.細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài):實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度,盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(一般通過(guò)檢測(cè)OD600來(lái)控制。DH5α菌株OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是5×107/ml);
2.所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件和冰上進(jìn)行;
3.經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞,在低溫條件下,一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加,24小時(shí)達(dá)到zui高,之后轉(zhuǎn)化率再下降(這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的);
4.化合物及無(wú)機(jī)離子的影響:在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高(100-1000倍);
5.所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率;
6.質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響:用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA;
7.一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比;
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