·CaCl2感受態細胞的制備的實驗步驟

　　1．前夜接種受體菌（DH5α或DH10B），挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜（約16小時）；

　　2．取1ml過夜培養物轉接于100mlLB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3小時（250-300rpm）；

　　3．將0.1MCaCl2溶液置于冰上預冷；

　　以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作

　　4．吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；

　　5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

　　6．棄去上清，加入100μl預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；

　　7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

　　8．棄去上清，加入100μl預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

　　9．細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑（15%-20%甘油）后超低溫冷凍貯存備用（－70℃）。

　　·電轉化法制備大腸桿菌感受態細胞的實驗步驟

　　1．前夜接種受體菌（DH5α或DH10B），挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜；

　　2．取2ml過夜培養物轉接于200mlLB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養至OD600=0.6（約2.5-3小時）；

　　3．將菌液迅速置于冰上。以下步驟務必在超凈工作臺和冰上操作

　　4．吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；

　　5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

　　6．棄去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸?。?/p>

　　7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

　　8．棄去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

　　9．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

　　10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；

　　11．立即使用或迅速置于-70℃超低溫保存。

　　附注：

　　影響感受態細胞轉化效率的因素及實際操作過程中應注意的事項：

　　1．細菌的生長狀態：實驗中應密切注視細菌的生長狀態和密度，盡量使用對數生長期的細胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5α菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml）；

　　2．所有操作均應在無菌條件和冰上進行；

　　3．經CaCl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加，24小時達到zui高，之后轉化率再下降（這是由于總的活菌數隨時間延長而減少造成的）；

　　4．化合物及無機離子的影響：在Ca2+的基礎上聯合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，可使轉化效率大大提高（100-1000倍）；

　　5．所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率；

　　6．質粒的大小及構型的影響：用于轉化的應主要是超螺旋的DNA；

　　7．一定范圍內，轉化效率與外源DNA的濃度呈正比；