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·CaCl2感受態細胞的制備的實驗步驟
1.前夜接種受體菌(DH5α或DH10B),挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜(約16小時);
2.取1ml過夜培養物轉接于100mlLB培養基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3小時(250-300rpm);
3.將0.1MCaCl2溶液置于冰上預冷;
以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作
4.吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘;
5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;
6.棄去上清,加入100μl預冷0.1MCaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮,在冰放置20分鐘;
7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;
8.棄去上清,加入100μl預冷0.1MCaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;
9.細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑(15%-20%甘油)后超低溫冷凍貯存備用(-70℃)。
·電轉化法制備大腸桿菌感受態細胞的實驗步驟
1.前夜接種受體菌(DH5α或DH10B),挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜;
2.取2ml過夜培養物轉接于200mlLB培養基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養至OD600=0.6(約2.5-3小時);
3.將菌液迅速置于冰上。以下步驟務必在超凈工作臺和冰上操作
4.吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘;
5.4℃下3000g冷凍離心5分鐘;
6.棄去上清,加入1500μl冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;
7.4℃下3000g冷凍離心5分鐘
8.棄去上清,加入750μl冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;
9.4℃下3000g冷凍離心5分鐘
10.加入20μl冰冷10%的甘油,用移液器輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;
11.立即使用或迅速置于-70℃超低溫保存。
附注:
影響感受態細胞轉化效率的因素及實際操作過程中應注意的事項:
1.細菌的生長狀態:實驗中應密切注視細菌的生長狀態和密度,盡量使用對數生長期的細胞(一般通過檢測OD600來控制。DH5α菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml);
2.所有操作均應在無菌條件和冰上進行;
3.經CaCl2處理的細胞,在低溫條件下,一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加,24小時達到zui高,之后轉化率再下降(這是由于總的活菌數隨時間延長而減少造成的);
4.化合物及無機離子的影響:在Ca2+的基礎上聯合其他二價金屬離子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或還原劑等物質處理細菌,可使轉化效率大大提高(100-1000倍);
5.所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率;
6.質粒的大小及構型的影響:用于轉化的應主要是超螺旋的DNA;
7.一定范圍內,轉化效率與外源DNA的濃度呈正比;
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